Μελέτη της διάχυσης αιωρημάτων των πρωτεϊνών του φακού με δυναμική σκέδαση φωτός: συσχετισμός με το φαινόμενο του καταρράκτη

Abstract

Protein condensation is the molecular basis for many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and lens cataract. The cause of protein condensation (aggregation and/or phase separation) and the route to the condensed state are still a matter of debate, despite the intense research efforts on the subject. The present dissertation aims at studying the molecular basis of lens cataract in mammal lenses. The fact that the lens is a complex, dense dispersion of proteins (called crystallines) in water is an important obstacle that makes the understanding of the cataract onset in the lens a tough problem if not an impossible task. A strategy to overcome this obstacle is to study the cataract onset in simpler systems, e.g. dispersions of the various crystalline species at various protein concentrations ranging from very dilute dispersions to dense ones such as the intact lens. In this work we investigate the dynamics of bovine lens proteins dispersions by means of Dynamic Light Scattering, in an effort to reveal possible correlations of their behavior with the cataract effect. Two models of cataract were studied; the “cold” cataract, that is caused by cooling lens proteins below 17 οC and the “heat-induced” cataract, caused by heating lens proteins above ~45-50 οC. The temperature dependence of the diffusion coefficient was studied over a wide range of concentrations, from the very dilute limit up to the dense regime approaching lens concentration. The studies were carried out for three different young bovine lens protein dispersions. (a) Lens homogenates consist of the total lens content, (b) homogenate dispersions of the nucleus content, and (c) dispersions of isolated α-crystallins, i.e. the species that dominate in DLS among lens proteins. α-crystallins were separated from the mixture of lens proteins by using gel-filtration chromatography. The main conclusions of the present work are the following. The dynamics of lens protein dispersions are described by four diffusion mechanisms: one collective diffusion process that appears at moderate concentrations, c>75 mg/ml, and becomes faster with increasing concentration and three self-diffusion processes of α-crystallins, HMα-crystallins and large aggregates of crystallins (c>200 mg/ml). Self-diffusion becomes slower with increasing concentration. All diffusion mechanisms become slower by lowering the temperature of the dispersions. The same holds when the dispersions are heated at a constant temperature above 50 οC by increasing the heating time. Concerning “cold” cataract, it was observed that the scattered intensity grows rapidly, while “domains” of very high concentration appear for T<TC, where TC denotes the critical temperature for “cold” cataract formation.

Στη διδακτορική αυτή διατριβή πραγματοποιείται η μελέτη των δυναμικών ιδιοτήτων των πρωτεϊνών του βοδινού φακού με τη μέθοδο της Δυναμικής Σκέδασης Φωτός και επιχειρείται ο συσχετισμός των ιδιοτήτων αυτών με το φαινόμενο του καταρράκτη. Μελετήθηκαν δυο μοντέλα καταρράκτη, ο «ψυχρός» καταρράκτης, που προκύπτει με ψύξη του φακού κάτω από τους 17 οC και ο «θερμός» καταρράκτης που προκύπτει με θέρμανση του φακού πάνω από τους 50 οC. Οι μετρήσεις στις διάφορες θερμοκρασίες πραγματοποιήθηκαν σε όλο το φάσμα συγκεντρώσεων, από πολύ αραιά μέχρι πολύ πυκνά αιωρήματα των πρωτεϊνών του φακού. Επιπλέον, μελετήθηκαν τρία ξεχωριστά συστήματα: ομογενή αιωρήματα α) από ολόκληρους φακούς νεαρών βοδιών, β) από τους πυρήνες των φακών νεαρών βοδιών και γ) α-κρυσταλλινών, οι οποίες αποτελούν το είδος των πρωτεϊνών με το μεγαλύτερο ποσοστό στο φακό (45 %) και επιπλέον έχουν το μεγαλύτερο μοριακό βάρος (800 kDa). Για τη μελέτη των α-κρυσταλλινών, προηγήθηκε απομόνωση και διαχωρισμός των διάφορων ειδών πρωτεϊνών του φακού με χρωματογραφία πηκτής. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι: Τα αιωρήματα των πρωτεϊνών του φακού περιγράφονται από τέσσερις μηχανισμούς διάχυσης: τη συλλογική διάχυση, η οποία εμφανίζεται σε ενδιάμεσες συγκεντρώσεις (c>75 mg/ml) και γίνεται βαθμιαία πιο γρήγορη όταν αυξάνει η συγκέντρωση και την αυτοδιάχυση των α-κρυσταλλινών, των HMα-κρυσταλλινών και των συσσωματωμάτων των κρυσταλλινών (c>200 mg/ml), η οποία γίνεται βαθμιαία πιο αργή με αύξηση της συγκέντρωσης. Όλοι οι μηχανισμοί διάχυσης γίνονται βαθμιαία πιο αργοί κατά την ψύξη των αιωρημάτων. Το ίδιο ισχύει και κατά τη θέρμανση σε μια σταθερή θερμοκρασία (Τ>50 οC) με την αύξηση του χρόνου θέρμανσης. Όσο αυξάνεται η συγκέντρωση σε μια δεδομένη υψηλή θερμοκρασία (Τ>50 οC) αυξάνεται και ο αριθμός ή/και το μοριακό βάρος των συσσωματωμάτων των κρυσταλλινών. Όσο αφορά τον ψυχρό καταρράκτη, η σκεδαζόμενη ένταση αυξάνεται απότομα, ενώ εμφανίζονται «περιοχές» υψηλής συγκέντρωσης για T<TC, όπου TC η κρίσιμη θερμοκρασία σχηματισμού του ψυχρού καταρράκτη. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από τη διδακτορική αυτή διατριβή είναι σημαντικά για την κατανόηση των βασικών μηχανισμών των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών του φακού τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές συνθήκες, καθώς επίσης για την έγκαιρη διάγνωση των πρώιμων σταδίων του γεροντικού καταρράκτη.