Διερεύνηση της γενετικής προδιάθεσης της μυασθένειας στον ελληνικό πληθυσμό: ο ρόλος του NLRP3 φλεγμονοσώματος και του σηματοδοτικού μονοπατιού IL12/STAT4

Abstract

Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease mediated by the presence of autoantibodies that bind mainly to the acetylcholine receptor (AChR) and other proteins in the neuromuscular junction, leading to defect in muscle contraction. The involvement of the thymus gland in the pathogenesis of MG is crucial, as it constitutes the site of sensitization of autoreactive cells against the AChR subunits. This thesis aims to identify new genetic markers that contribute to the genetic predisposition of MG in the Greek population. A case-control association study was conducted analyzing common variants (SNVs) located in genes of the IL12/STAT4 and IL10/STAT3 signaling pathways and the pathway induced by NLRP3 inflammasome. A total of 175 sporadic MG patients of Greek descent, positively detected with anti-AChR autoantibodies were enrolled in the study. MG cases were subdivided into two groups according to the age of disease onset: 85 EOMG patients ≤ 50 years and 90 LOMG ≥ 60 years. Furthermore, the thymic transcription levels of STAT4, STAT3 and IL12RB2 were determined in a group of 16 non-MG individuals. Our aim was to investigate whether the intronic variants rs7574865, rs744166 and rs6679356 have a possible functional impact that could modify the mRNA expression levels of the respective genes in thymus. The SNVs that displayed the strongest signals of association with MG were rs6679356 in IL12RB2 and rs7574865 in STAT4. Concerning the rs7574865 variant of STAT4, the strongest association emerged between EOMG patients and controls for T allele (p=0.0115) and T/T genotype (p=0.0181) distributions. The minor T allele (OR=1.9) and the homozygous T/T genotype (OR=4.1) showed higher frequency in patients than in controls, suggesting that the rs7574865 T allele could be a risk allele for EOMG. Statistically significant differences in C allele and C/C genotype distributions of rs6679356 were detected between the LOMG subgroup and controls with p=0.0152 and OR=0.56 and p=0.0185 and OR=0.21, respectively. Regarding rs744166 in STAT3, statistical analysis revealed a borderline association in the case of G allele distribution between the total group of MG patients and controls, as indicated by the value p=0.0505. Our investigation of the correlation between the MG-associated variants and the expression levels of STAT4, STAT3 and IL12RB2 in thymus did not result in significant differences. Finally, the genetic association study of NLRP3 inflammasome included genotyping of 74 SNVs located in NLRP3, CARD8, PYCARD and CASP1 loci, using the Illumina Infinium PsychArray - 24v1.1 BeadChip. The most significant associations with MG were identified in the cases of SNVs rs10159239 in NLRP3 (p=0.0085 και OR=0.65) and rs2282659 in CASP1 (p=0.0118 και OR=1.56) that exceeded the nominal significance level (p < 0.05).

Η Μυασθένεια είναι μια αυτοάνοση νόσος της νευρομυϊκής σύναψης που χαρακτηρίζεται από την παραγωγή αυτοαντισωμάτων έναντι, συνήθως, του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AChR), καθώς και άλλων πρωτεϊνών της σύναψης, με αποτέλεσμα τη διαταραχή της μυικής συστολής. Παρότι οι σκελετικοί μύες αποτελούν το όργανο-στόχο των αυτοαντισωμάτων, ο ρόλος του θύμου αδένα στην ανάπτυξη της ειδικής αυτοάνοσης απόκρισης έναντι του AChR είναι καθοριστικός. Η παρούσα διατριβή στοχεύει στην ταυτοποίηση πιθανών νέων γενετικών δεικτών που θα ερμηνεύουν μέρος της προδιάθεσης για την ανάπτυξη Μυασθένειας στον ελληνικό πληθυσμό. Αρχικά, διεξήχθη μια μελέτη γενετικής συσχέτισης της Μυασθένειας με κοινές παραλλαγές (SNVs) που εδράζονται σε γονίδια των σηματοδοτικών μονοπατιών IL12/STAT4 και IL10/STAT3, καθώς και του επαγόμενου από το φλεγμονόσωμα NLRP3 μονοπατιού. Συνολικά, συλλέχθηκαν 175 σποραδικά περιστατικά Μυασθένειας, ελληνικής καταγωγής, εκ των οποίων τα 85 εμφάνισαν πρώιμη έναρξη της νόσου (EOMG ≤ 50 ετών) και τα 90 εκδήλωσαν τη Μυασθένεια σε ηλικία ≥ 60 ετών (LOMG). Σε δεύτερη φάση, πραγματοποιήθηκε μια μελέτη γονιδιακής έκφρασης, κατά την οποία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα μεταγραφής των STAT4, STAT3 και IL12RB2 στον θύμο αδένα ατόμων που δεν έπασχαν από Μυασθένεια (Ν=16) και διερευνήθηκε η πιθανότητα σύνδεσης των υπό εξέταση γονοτύπων με τα επίπεδα έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου. Η ισχυρότερη συσχέτιση παρατηρήθηκε στην κατανομή του αλληλομόρφου Τ και του γονοτύπου Τ/Τ του SNV rs7574865 (STAT4) μεταξύ των EOMG και της ομάδας αναφοράς (p=0,0115 και p=0,0181, αντίστοιχα). H παρουσία του αλληλομόρφου T συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο εκδήλωσης EOMG (OR=1,9), ο οποίος είναι πολύ υψηλότερος (OR=4,1) σε ομοζυγώτες Τ/Τ. Στατιστικά σημαντική συσχέτιση προέκυψε και στην περίπτωση του αλληλομόρφου C (p=0,0152 και OR=0,56) και του γονοτύπου C/C (p=0,0185 και OR=0,21) του SNV rs6679356 (IL12RB2), μεταξύ των LOMG και της ομάδας αναφοράς. Η κατανομή του αλληλομόρφου G του rs744166 (STAT3) στο σύνολο των μυασθενών συγκριτικά με την ομάδα αναφοράς, προσέγγισε τα επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας (p=0,0505). Η διερεύνηση της σύνδεσης των παραπάνω γονοτύπων με τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων STAT4, STAT3 και IL12RB2, στον θύμο αδένα δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντικά ευρήματα. Στη μελέτη του φλεγμονοσώματος NLRP3, εξετάσθηκαν 74 συνολικά SNVs, μέσω χρήσης της πλατφόρμας Illumina Infinium PsychArray - 24v1.1, οι οποίοι καλύπτουν σημαντικό μέρος της γενετικής ποικιλομορφίας των τεσσάρων γενετικών τόπων NLRP3, CARD8, PYCARD και CASP1. Οι σημαντικότερες συσχετίσεις παρατηρήθηκαν στις περιπτώσεις των SNVs rs10159239 του NLRP3 (p=0,0085 και OR=0,65) και rs2282659 του CASP1 (p=0,0118 και OR=1,56), οι οποίοι ξεπέρασαν το ονομαστικό επίπεδο σημαντικότητας (p<0,05).