Επίδραση της σύνθεσης και της δομής στη βιοδιάσπαση και την κυτταροσυμβατότητα μικρο-νανοϊνωδών πολυμερικών βιοϋλικών

Abstract

Given the limited regenerative capacity of human tissues, numerous surgical procedures are performed daily worldwide to replace and restore damaged tissues. The remarkable progress made in recent decades in the fields of materials science, engineering, and medicine aims to restore the functionality of damaged tissues through the integration of cells into biocompatible and biodegradable porous constructs known as scaffolds. Scaffolds, as three-dimensional (3D) substrates, serve as ideal templates for tissue regeneration, simulating the structure of the extracellular matrix (ECM). Among the techniques used for scaffold fabrication, electrospinning stands out as an ideal approach due to its ability to produce structures that mimic the characteristics of the extracellular matrix (ECM). However, the types of materials to be used for scaffold fabrication, as well as the functional requirements needed for each specific application, must be carefully considered. Many biodegradable synthetic polymers, either hydrophobic like poly-ε-caprolactone (PCL) or hydrophilic like poly(vinyl alcohol) (PVA), are widely used as candidate bioactive materials for tissue engineering scaffold fabrication. However, scaffolds made from hydrophobic polymers often exhibit limited cytocompatibility and difficulty in cell integration, whereas hydrophilic polymers, although having good biocompatibility, often lack the necessary mechanical strength. These limitations hinder the efficient use of scaffolds in in vivo tissue regeneration, necessitating the exploration of innovative approaches. The combination of hydrophobic and hydrophilic polymers has been proposed as a solution to address these limitations. The present study aims to leverage the advantages of both types of polymers by creating composite scaffolds through electrospinning for applications in Tissue Engineering. Specifically, the combined use of hydrophobic PCL and hydrophilic PVA aims to develop scaffolds with improved mechanical properties, increased cytocompatibility, and controlled-rate biodegradation, thereby achieving better cell adhesion and integration, and ultimately promoting effective tissue regeneration in vitro. For this purpose, three groups of scaffolds were developed using the electrospinning technique: i) single-layered PCL scaffolds, ii) tri-layered composite scaffolds (PVA/PCL/PVA), and iii) coaxial core-shell structured composite scaffolds (PVA as the shell and PCL as the core). The study investigated how the synergistic use of hydrophilic and hydrophobic polymers can enhance the properties of scaffolds for their use in tissue engineering. The research focused particularly on the architectural structure of the core-shell scaffolds, due to their innovative nature and limited reference in existing literature. Coaxial electrospinning, the technique used to create these scaffolds, is a relatively recent development in the field of materials science and engineering and has not been extensively studied. This highlights the innovative aspect of the present research, making it particularly significant for the further development and understanding of the potential of this promising technique. In the context of the study, the structural and biomechanical properties of the scaffolds were thoroughly compared before and after their hydrolytic degradation, which was conducted over a period of seven months following immersion in phosphate-buffered saline (PBS) at 37°C. Additionally, the scaffolds were subjected to in vitro tests, where human embryonic kidney cells (HEK-293) were cultured on them to investigate potential cell attachment, infiltration, and proliferation. The key findings from the study include achieving an extremely homogeneous fiber size and distribution in all types of scaffolds, thanks to the optimized electrospinning parameters selected, thus ensuring a consistent spinning process. The surface properties were significantly enhanced in the tri-layered and core-shell scaffolds through the addition of hydrophilic PVA, substantially improving the hydrophilicity and biocompatibility of the scaffolds. This improvement is essential for promoting smooth cell adhesion and proliferation. The results from Scanning Electron Microscopy (SEM) and Transmission Electron Microscopy (TEM) images revealed that all scaffolds exhibited smooth, uniform, and aligned fibers, contributing to dense three-dimensional structures suitable for tissue engineering applications. The scaffolds displayed fiber diameters at nano- and microscale, with microscale pore sizes necessary for cell infiltration and tissue regeneration. Specifically, the core-shell scaffolds exhibited a relatively uniform distribution in fiber diameter, indicating consistent fiber structure compared to other types of scaffolds. The in vitro degradation studies conducted over a period of seven months highlighted the role of the hydrophilic component PVA in enhancing water uptake. The tri-layered scaffolds exhibited gradual thinning due to degradation of the outer PVA layer, while the core-shell scaffolds maintained their structural integrity longer, indicating prolonged biodegradation. Mechanically, all types of scaffolds showed increased stiffness (measured by Young's modulus and ultimate tensile strength) after degradation, possibly influenced by the presence of crystalline degradation products. However, the core-shell scaffolds exhibited a significant increase in Young's modulus (40.7%) after seven months of degradation in PBS, indicating improved mechanical stability over time compared to single-layered scaffolds that showed moderate increase (18%) and tri-layered scaffolds that maintained a moderate increase (15.6%) throughout the in vitro degradation. Furthermore, the ultimate tensile strength (UTS) results showed that core-shell and tri-layered scaffolds exhibited higher strength values (7.12 ± 0.36 MPa and 6.8 ± 0.36 MPa, respectively) compared to single-layered scaffolds (2.02 ± 0.18 MPa) and maintained or improved their strength during the degradation period. Finally, maximum strain results indicated that while single-layered scaffolds initially exhibited higher ductility, they experienced the greatest reduction over time under degradation conditions. On the other hand, core-shell scaffolds showed a more stable strain profile, indicating better maintenance of ductility compared to tri-layered scaffolds. In summary, core-shell scaffolds demonstrate promising mechanical properties, offering a balanced combination of mechanical strength, stability, and ductility, making them ideal for Tissue Engineering applications where robust mechanical support and controlled biodegradation are required. The evaluations from cell culture studies revealed superior cellular biocompatibility for the core-shell scaffolds, promoting better cell adhesion and proliferation compared to single-layered and tri-layered scaffolds. The hydrophilic PVA layer played a critical role in enhancing scaffold hydrophilicity and strengthening cellular responses. Overall, the study demonstrates the effectiveness of coaxial electrospinning for producing composite scaffolds with enhanced biocompatibility, controlled biodegradation, and improved mechanical properties. The results indicated that the bioresorbable fibrous core-shell scaffolds developed in this study could be an attractive choice for Tissue Engineering and Regenerative Medicine applications. Their unique architecture allows for smooth degradation, avoiding burst effects, while maintaining good long-term mechanical properties and supporting cell growth without any external chemical or physical stimuli.

Δεδομένης της περιορισμένης αναγεννητικής ικανότητας των ανθρώπινων ιστών, πολυάριθμες χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιούνται καθημερινά σε παγκόσμιο επίπεδο για την αντικατάσταση και αποκατάσταση κατεστραμμένων ιστών. Η αξιοσημείωτη πρόοδος που έχει σημειωθεί τις τελευταίες δεκαετίες στον τομέα της επιστήμης των υλικών, της μηχανικής και της ιατρικής, στοχεύει στην αποκατάσταση της λειτουργικότητας των κατεστραμμένων ιστών μέσω της ενσωμάτωσης κυττάρων σε βιοσυμβατά και βιοαποδομήσιμα πορώδη κατασκευάσματα, γνωστά ως ικριώματα. Τα ικριώματα, ως τρισδιάστατα (3D) υποστρώματα, χρησιμεύουν ως ιδανικά πρότυπα για την αναγέννηση των ιστών, προσομοιώνοντας τη δομή της εξωκυτταρικής μήτρας (Extracellular Matrix, ECM). Μεταξύ των τεχνικών που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή των ικριωμάτων, η ηλεκτροϊνοποίηση (Electrospinning) ξεχωρίζει ως ιδανική προσέγγιση λόγω της ικανότητάς της να παράγει δομές που μιμούνται τα χαρακτηριστικά της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM). Ωστόσο, οι τύποι των υλικών που θα χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή ενός ικριώματος, καθώς και οι λειτουργικές απαιτήσεις που χρειάζεται να πληροί για την εκάστοτε εφαρμογή του, πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψη. Πολλά βιοαποδομήσιμα συνθετικά πολυμερή, είτε υδρόφοβα, όπως η πολυ-ε-καπρολακτόνη (PCL), είτε υδρόφιλα, όπως η πολυ(βινυλική αλκοόλη) (PVA), χρησιμοποιούνται ευρέως ως υποψήφια βιοδραστικά υλικά για την κατασκευή ικριωμάτων μηχανικής ιστών. Ωστόσο, τα ικριώματα που κατασκευάζονται από υδρόφοβα πολυμερή, συχνά παρουσιάζουν περιορισμένη κυτταροσυμβατότητα και δυσκολία στην ενσωμάτωση κυττάρων, ενώ τα υδρόφιλα πολυμερή, παρόλο που έχουν καλή βιοσυμβατότητα, συχνά στερούνται την απαραίτητη μηχανική αντοχή. Αυτοί οι περιορισμοί εμποδίζουν την αποδοτική χρήση των ικριωμάτων στην in vivo αναγέννηση ιστών, καθιστώντας αναγκαία την αναζήτηση καινοτόμων προσεγγίσεων. Ο συνδυασμός υδρόφοβων και υδρόφιλων πολυμερών έχει προταθεί ως λύση για την αντιμετώπιση αυτών των περιορισμών. Η παρούσα διατριβή επιδιώκει να αξιοποιήσει τα πλεονεκτήματα και των δύο τύπων πολυμερών δημιουργώντας σύνθετα ικριώματα μέσω ηλεκτροϊνοποίησης για εφαρμογές στην Ιστομηχανική. Συγκεκριμένα, η συνδυασμένη χρήση της υδρόφοβης PCL και της υδρόφιλης PVA στοχεύει στην ανάπτυξη ικριωμάτων με βελτιωμένες μηχανικές ιδιότητες, αυξημένη κυτταροσυμβατότητα και βιοαποικοδόμηση με ελεγχόμενο ρυθμό, επιτυγχάνοντας έτσι καλύτερη κυτταρική προσκόλληση και ενσωμάτωση, και τελικά προάγοντας την αποτελεσματική αναγέννηση των ιστών in vitro. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκαν τρεις ομάδες ικριωμάτων χρησιμοποιώντας την τεχνική της ηλεκτροϊνοποίησης: i) ικριώματα PCL μονής στρώσης (single-layered), ii) σύνθετα ικριώματα τριών διαδοχικών στρωμάτων (PVA/PCL/PVA) (tri-layered), και iii) ομοαξονικά ικριώματα σύνθετης δομής πυρήνα-κελύφους (PVA ως κέλυφος και PCL ως πυρήνας) (core-shell). Διερευνήθηκε πώς η συνεργατική χρήση υδρόφιλων και υδρόφοβων πολυμερών μπορεί να βελτιώσει τις ιδιότητες των ικριωμάτων για τη χρήση τους στην Ιστομηχανική. Η έρευνα επικεντρώθηκε ιδιαίτερα στην αρχιτεκτονική δομή των ικριωμάτων πυρήνα-κελύφους (core-shell), λόγω της καινοτόμου φύσης της και της περιορισμένης αναφοράς στην υπάρχουσα βιβλιογραφία. Η ομοαξονική ηλεκτροϊνοποίηση, η τεχνική που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία αυτών των ικριωμάτων, αποτελεί μια σχετικά πρόσφατη εξέλιξη στον τομέα της επιστήμης και της μηχανικής των υλικών και δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Αυτό υπογραμμίζει την καινοτόμο πτυχή της παρούσας έρευνας, καθιστώντας την ιδιαίτερα σημαντική για την περαιτέρω ανάπτυξη και κατανόηση των δυνατοτήτων αυτής της πολλά υποσχόμενης τεχνικής. Στα πλαίσια της μελέτης, οι δομικές και εμβιομηχανικές ιδιότητες των ικριωμάτων συγκρίθηκαν διεξοδικά πριν και μετά την υδρολυτική αποικοδόμησή τους, η οποία διεξήχθη σε περίοδο επτά μηνών μετά από εμβάπτιση σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) στους 37°C. Επιπροσθέτως, τα ικριώματα υποβλήθηκαν σε in vitro δοκιμές, όπου ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (HEK-293) καλλιεργήθηκαν επάνω σε αυτά για να διερευνηθεί η πιθανή προσκόλληση, διήθηση και πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Τα βασικά ευρήματα από τη μελέτη περιλαμβάνουν την επίτευξη εξαιρετικά ομοιογενούς μεγέθους και κατανομής ινών σε όλους τους τύπους ικριωμάτων, χάρη στις βελτιστοποιημένες παραμέτρους ηλεκτροϊνοποίησης που επιλέχθηκαν, διασφαλίζοντας έτσι μια σταθερή διαδικασία ινοποίησης. Οι επιφανειακές ιδιότητες ενισχύθηκαν σημαντικά στα ικριώματα τριών στρωμάτων (tri-layered) και πυρήνα-κελύφους (core-shell) μέσω της προσθήκης της υδρόφιλης PVA, βελτιώνοντας ουσιαστικά την υδροφιλικότητα και τη βιοσυμβατότητα των ικριωμάτων. Αυτή η βελτίωση, είναι απαραίτητη για την προώθηση της ομαλής προσκόλλησης και πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα αποτελέσματα από τις εικόνες της Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (SEM) και Διερχόμενης Δέσμης (ΤΕΜ) αποκάλυψαν ότι όλα τα ικριώματα εμφάνισαν λείες, ομοιόμορφες και ευθυγραμμισμένες ίνες, συμβάλλοντας σε πυκνές τρισδιάστατες δομές κατάλληλες για εφαρμογές μηχανικής ιστών. Τα ικριώματα επέδειξαν διαμέτρους ινών σε νανο- και μικροκλίμακα, με μεγέθη πόρων μικροκλίμακας, απαραίτητα για την κυτταρική διήθηση και την αναγέννηση των ιστών. Συγκεκριμένα, τα core-shell ικριώματα παρουσίασαν αρκετά ομοιόμορφη κατανομή στη διάμετρο των ινών, υποδηλώνοντας συνεπή δομή των ινών σε σύγκριση με τους άλλους τύπους ικριωμάτων. Οι μελέτες αποικοδόμησης in vitro που πραγματοποιήθηκαν σε διάστημα επτά μηνών τόνισαν τον ρόλο του υδρόφιλου συστατικού PVA στην ενίσχυση της πρόσληψης νερού. Τα tri-layered ικριώματα παρουσίασαν σταδιακή μείωση του πάχους λόγω της υποβάθμισης του εξωτερικού στρώματος PVA, ενώ τα core-shell ικριώματα διατήρησαν τη δομική τους ακεραιότητα περισσότερο, υποδηλώνοντας παρατεταμένη βιοαποικοδόμηση. Μηχανικά, όλοι οι τύποι ικριωμάτων εμφάνισαν αυξημένη ακαμψία (μετρούμενη από το μέτρο του Young και την τελική αντοχή εφελκυσμού) μετά την αποικοδόμηση, πιθανότατα επηρεασμένη από την παρουσία κρυσταλλικών προϊόντων υδρόλυσης. Ωστόσο, τα core-shell ικριώματα έδειξαν σημαντική αύξηση στο μέτρο του Young (40,7%) μετά από την επτάμηνη υποβάθμιση σε PBS, υποδεικνύοντας βελτιωμένη μηχανική σταθερότητα με την πάροδο του χρόνου, σε σύγκριση με τα single-layered ικριώματα που παρουσίασαν μέτρια αύξηση (18%) και τα tri-layered ικριώματα που διατήρησαν έναν συντελεστή μέτριας αύξησης (15,6%) καθ' όλη τη διάρκεια της in vitro αποδόμησης. Ακολούθως, τα αποτελέσματα της μέγιστης αντοχής σε εφελκυσμό (UTS) έδειξαν ότι τα core-shell και tri-layered ικριώματα εμφάνισαν υψηλότερες τιμές αντοχής (7,12 ± 0,36 MPa και 6,8 ± 0,36 MPa, αντίστοιχα) από τα single-layered ικριώματα (2,02 ± 0,18 MPa) και διατήρησαν ή βελτίωσαν την αντοχή τους κατά την περίοδο υποβάθμισης. Τέλος, από τα αποτελέσματα της μέγιστης καταπόνησης (maximum strain), τα single-layered ικριώματα ενώ αρχικά εμφάνισαν την υψηλότερη ολκιμότητα, παρουσίασαν ωστόσο τη μεγαλύτερη μείωση με την πάροδο του χρόνου στις συνθήκες υποβάθμισης. Από την άλλη, τα core-shell ικριώματα παρουσίασαν ένα πιο σταθερό προφίλ καταπόνησης, υποδηλώνοντας καλύτερη διατήρηση της ολκιμότητας σε σύγκριση με τα tri-layered ικριώματα. Συνόπτικά, τα core-shell ικριώματα επιδεικνύουν ενθαρρυντικές μηχανικές ιδιότητες, αφού φαίνεται να προσφέρουν έναν ισορροπημένο συνδυασμό μηχανικής αντοχής, σταθερότητας και ολκιμότητας, καθιστώντάς τα ιδανικά για εφαρμογές Ιστομηχανικής, όπου απαιτείται στιβαρή μηχανική υποστήριξη και ελεγχόμενη βιοδιάσπαση. Οι αξιολογήσεις από τις μελέτες κυτταροκαλλιέργειας αποκάλυψαν ανώτερη κυτταρική βιοσυμβατότητα για τα core-shell ικριώματα, προάγοντας καλύτερα την κυτταρική προσκόλληση και πολλαπλασιασμό σε σύγκριση με τα single-layered και tri-layered. Το υδρόφιλο στρώμα PVA όπως φαίνεται, έπαιξε κρίσιμο ρόλο στη βελτίωση της υδροφιλίας του ικριώματος και στην ενίσχυση των κυτταρικών αποκρίσεων. Συνολικά, η μελέτη καταδεικνύει την αποτελεσματικότητα της ομοαξονικής ηλεκτροϊνοποίησης για την παραγωγή σύνθετων ικριωμάτων με αυξημένη βιοσυμβατότητα, ελεγχόμενη βιοαποικοδόμηση και βελτιωμένες μηχανικές ιδιότητες. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τα βιοαποικοδομήσιμα ινώδη ικριώματα δομής πυρήνα-κελύφους (core-shell) που αναπτύχθηκαν σε αυτή τη μελέτη, θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια ελκυστική επιλογή για εφαρμογές Ιστομηχανικής και Αναγεννητικής Ιατρικής. Η μοναδική αρχιτεκτονική τους, επιτρέπει την ομαλή υποβάθμιση, αποφεύγοντας τα φαινόμενα αιφνίδιας ρήξης (burst effects), διατηρώντας καλές μακροπρόθεσμες μηχανικές ιδιότητες και υποστηρίζοντας την ανάπτυξη των κυττάρων, χωρίς κανένα εξωτερικό χημικό ή φυσικό ερέθισμα.