Διερεύνηση των ανθεκτικών στα αντιβιοτικά στελεχών Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae και Acinetobacter spp. σε δείγματα σφαγίων και κρέατος ορνιθίων, περιβάλλοντος και ανθρώπων, με βάση την αρχή της Ενιαίας Υγείας.

Abstract

The advent of antimicrobial therapy in the mid-20th century revolutionized the treatment of bacterial infections. However, the misuse and overuse of antibiotics have led to the emergence of antibiotic-resistant bacteria. Animals and the environment are now considered major reservoirs for these resistant bacteria and resistance factors. Pathogenic bacteria such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Acinetobacter spp. are frequently isolated from animals and food of animal origin, posing severe risk as they are linked to serious hospital-acquired infections. Treating these infections is increasingly challenging due to their resistance to even last-resort antibiotics like carbapenems. Recent research has focused on the potential transfer of resistant pathogenic bacteria or resistance factors from animals to humans. Studies suggest this transfer is significant, involving both companion animals and livestock, as well as animal products. Among livestock, poultry play a crucial role due to intensive farming practices, veterinary interventions, and widespread antimicrobial use. While numerous studies report the isolation of antibiotic-resistant bacterial strains from animals and foods, there is a lack of comparative analysis of these strains. Additionally, the pathways through which resistant bacteria are transferred from animals, food, and the environment to humans are not well-characterized. This gap in understanding hinders efforts to control the emergence and spread of antimicrobial resistance across the animal-food-environment-human chain. Therefore, studies within the One Health framework are needed to clarify the importance of food and the meat production chain in the transmission of antibiotic-resistant bacteria. This doctoral thesis has been performed into four parts. The first part focuses on isolating and characterizing strains of E. coli, K. pneumoniae, and Acinetobacter spp. of the A. calcoaceticus – A. baumannii complex, which carry genetic elements for producing β-lactamases (ESBL, AmpC, carbapenemases), from broiler chicken carcasses. Specifically, neck skin samples were collected from 600 whole poultry carcasses. These samples were obtained from animals raised in 32 farms across the regions of Central Macedonia and Epirus, covering all seasons from winter 2023 to winter 2024. The second part examines the isolation and characterization of strains of E. coli, K. pneumoniae, and Acinetobacter spp. of the A. calcoaceticus – A. baumannii complex, which possess genetic elements for the production of β-lactamases, from humans and the environment along the poultry meat production chain, including poultry farmers, slaughterhouse workers, the farm environment, and poultry slaughterhouses. Sampling was conducted seasonally from winter 2023 to autumn 2023 in 12 poultry farms and two slaughterhouses in the regions of Central Macedonia and Epirus. A total of 224 environmental samples were collected from various locations, including 100 samples from poultry farm environments and 124 samples from slaughterhouse environments. Additionally, 80 samples were obtained from farmers and slaughterhouse workers. The third part investigates the isolation and characterization of strains of E. coli, K. pneumoniae, and Acinetobacter spp. of the A. calcoaceticus – A. baumannii complex, which carry genetic elements for the production of β-lactamases, from the hospital environment, particularly focusing on hospital kitchens and staff involved in patient feeding. Seasonal sampling was conducted from spring 2023 to winter 2024 in two hospitals in the regions of Central Macedonia and Epirus. In total, 200 environmental samples were collected from various locations within hospital kitchens, along with 40 chicken breast meat samples and 80 samples from kitchen staff. The fourth part aims to compare the isolated strains of E. coli, K. pneumoniae, and A. baumannii from the environment, animals, food, and humans within the One Health framework. Furthermore, the overall prevalence of resistant strains was determined, and potential factors contributing to their isolation from farmers and hospital kitchen workers were assessed through questionnaire-based analysis. According to the first part, the prevalence of ceftazidime-resistant strains of E. coli, K. pneumoniae, and Acinetobacter spp. in chicken carcasses was 40.8%, 3.3%, and 46.7%, respectively. The isolation rates of Acinetobacter spp. strains were significantly higher in the Epirus region, particularly during the winter. E. coli and K. pneumoniae strains exhibited resistance to multiple antibiotics, whereas Acinetobacter spp. strains generally showed sensitivity to many of the antibiotics tested. One K. pneumoniae strain also showed resistance to ertapenem. Most E. coli and Acinetobacter spp. strains were multidrug-resistant (MDR), while all K. pneumoniae strains were characterized as MDR or extensively drug-resistant (XDR). All E. coli strains were phenotypically confirmed as ESBL/AmpC producers, while half of the K. pneumoniae strains exhibited the ESBL phenotype and the other half the ESBL + AmpC phenotype. The most common resistance genes in E. coli strains were blaCTX-M of group 1 and blaTEM, while in K. pneumoniae strains, the blaSHV, blaCTX-M of group 1, blaOXA, and blaDHA genes were detected. Unlike E. coli and K. pneumoniae, only 10.2% of Acinetobacter spp. strains carried β-lactamase genes, mainly blaCTX-M of groups 1 and 9 and blaTEM genes. No carbapenemase genes were detected in any strain. In the main spectra dendrograms of MALDI-TOF MS, a small distance level was observed primarily among strains isolated from neck skin samples of the same farm and season. However, close relatedness was also observed among some strains isolated from different farms within the same region or even between different regions. Some strains isolated during different seasons, either from the same or different farms and regions, also showed small distance level. Finally, the phylogenetic analysis of E. coli strains has classified most strains into phylogenetic groups A and B1. Based on the second part, the prevalence of resistant strains of E. coli, K. pneumoniae, and Acinetobacter spp. in the farm environment was 15.0%, 11.0%, and 1.0%, respectively, while in the slaughterhouse environment it was 57.3%, 1.6%, and 25.8%, respectively. Seasonality significantly affected the prevalence of E. coli strains in both farm and slaughterhouse environments, with most strains isolated from farms during the summer and from slaughterhouses in the spring and summer. Similarly, the prevalence of E. coli strains in the farm environment were significantly higher in the Central Macedonia region compared to the Epirus region. Regarding human samples, two A. baumannii strains were isolated from the skin of two poultry farmers (16.7%), and one E. coli strain was isolated from the skin of one farmer (8.3%). E. coli and K. pneumoniae strains exhibited resistance to multiple antibiotics, whereas Acinetobacter spp. strains generally showed sensitivity to many of the antibiotics tested. All E. coli and K. pneumoniae strains, as well as most Acinetobacter spp. strains, were characterized as MDR. All E. coli and K. pneumoniae strains were phenotypically confirmed as ESBL/AmpC producers. The most commonly found ESBL genes in E. coli strains were blaCTX-M of group 1, blaTEM, and blaSHV. Similarly, the ESBL genes found in K. pneumoniae strains were blaCTX-M of group 1, blaSHV, blaTEM, and blaOXA-1-like. However, most strains of Acinetobacter spp. did not carry the β-lactamase genes examined, with 24.4% of the strains carrying blaCTX-M of group 1 and/or 9 genes. In the main spectra dendrograms of MALDI-TOF MS, close relationship was often observed among strains originating mainly from the same, but also different, farms and slaughterhouses within the same region and season. Additionally, certain strains from farms and slaughterhouses in different regions exhibited a small distance level between them. Some strains from the farm environment showed close relationship with specific strains from the slaughterhouse environment, while a small distance level was also observed among strains isolated during different seasons. In the phylogenetic analysis of E. coli strains, the majority were classified into phylogenetic groups A and B1. Based on the results of the farmers' questionnaires, various poor practices and behaviors were observed regarding the use and consumption of antibiotics, among broiler chicken flocks and humans regardless if they were tested positive for resistant strains. The third part of the dissertation showed that the prevalence of resistant strains of E. coli, K. pneumoniae, and Acinetobacter spp. in the hospital kitchen environment was 4.5%, 1.5%, and 15.0%, respectively. E. coli and K. pneumoniae strains were resistant to ceftazidime and meropenem, respectively, while seven out of 36 resistant Acinetobacter spp. strains were resistant to meropenem. Additionally, 14 ceftazidime-resistant E. coli strains were isolated from 35% of chicken samples. Regarding human samples, two Acinetobacter spp. strains were isolated from the skin of one chef (4% of the humans sampled). Seasonality significantly influenced the prevalence of E. coli strains in the kitchen environment, with most E. coli strains isolated during the summer. Furthermore, the prevalence of Acinetobacter spp. strains in the kitchen environment was significantly higher in the hospital of the Central Macedonia region compared to the hospital of the Epirus region. Concerning chicken samples, the prevalence of E. coli strains was significantly higher in Central Macedonia compared to Epirus. All E. coli strains were MDR and phenotypically confirmed as ESBL producers, while most environmental and clinical K. pneumoniae strains were XDR. Regarding environmental strains of Acinetobacter spp., most meropenem-sensitive strains were characterized as MDR, and all meropenem-resistant strains were classified as XDR. Additionally, 43.75% of clinical A. baumannii strains were characterized as pandrug-resistant. The blaCTX-M of group 1 genes were the most prevalent ESBL genes in E. coli strains, closely followed by the blaSHV genes. The blaSHV genes were the most frequently found ESBL genes in environmental K. pneumoniae strains, and all environmental K. pneumoniae strains also carried the KPC carbapenemase. Clinical K. pneumoniae strains carried more β-lactamase genes compared to environmental strains. Regarding Acinetobacter spp., only 6.5% of meropenem-sensitive strains carried β-lactamase genes, mainly blaTEM and blaCTX-M of group 1 or 2 genes. However, all meropenem-resistant environmental strains of Acinetobacter spp. carried β-lactamase genes, such as blaCTX-M of groups 1 and 9, blaTEM, blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaAIM, blaDIM, blaSIM, blaBIC, blaNDM, blaVIM and blaOXA-48-like. Similar genes were found in clinical A. baumannii strains. In the main spectra dendrograms of MALDI-TOF MS, close relationship was observed among strains isolated within the same hospital and season. However, a small distance level was also observed among strains isolated from different geographical regions and seasons. Additionally, a small distance level was observed between specific environmental strains and strains from food, as well as between certain clinical and environmental strains. In the phylogenetic analysis of E. coli strains, the majority were classified into phylogenetic groups A and B1. Based on the results of the kitchen staff questionnaires, various poor practices were recorded regarding the use and consumption of antibiotics among employees, regardless of the carriage of resistant strains. In the fourth part, the main spectra dendrograms of MALDI-TOF MS showed a high degree of similarity, primarily among strains isolated from similar habitats. However, a small distance level was also observed among strains from different habitats, such as poultry carcasses, farms, slaughterhouses, and hospitals (both environmental and clinical strains). The PFGE dendrogram revealed five pulsotypes, which included K. pneumoniae strains with 100% genetic similarity, indicating the spread of certain K. pneumoniae clones in farms and hospitals, and the dissemination of K. pneumoniae strains along the chicken production chain. The detection of 100% genetic similarity between a strain from a chicken carcass and a clinical strain strongly suggests the transfer of resistant K. pneumoniae strains from food to humans. Similar to the MALDI-TOF MS dendrogram, the PFGE dendrogram showed a high degree of similarity among strains isolated from the same region and season, as well as among strains isolated from different regions and seasons. As indicated by the whole genome sequencing results (WGS), the MALDI-TOF MS and PFGE findings may complement each other and can be used together to investigate the relatedness of strains isolated from different habitats. According to the WGS findings, the two examined K. pneumoniae strains belonged to the same sequence type (ST11), while the two examined A. baumannii strains belonged to different sequence types (ST2 for the clinical strain and ST241 for the strain from the chicken carcass). The K. pneumoniae and A. baumannii strains carried resistance genes for multiple antibiotic categories, as well as Inc type plasmids and Rep-3 family plasmids, respectively. The prevalence of E. coli and Acinetobacter spp. strains on the skin of community members was 1.8% and 5.3%, respectively. Among the variables of the human questionnaires, men were statistically more likely to carry resistant strains than women. In conclusion, the presence and spread of resistant strains of E. coli, K. pneumoniae, and Acinetobacter spp. along the chicken meat production chain is particularly evident. The selective isolation of resistant strains using antibiotics enhanced the recovery rates, providing a more accurate estimate of the true prevalence of resistant bacteria in various habitats. The detection of resistant clinical strains and strains from chicken meat with a very high degree of genetic similarity is a significant public health concern, highlighting food as a potential vector for transferring resistant strains or resistance genes to humans.

Η χρήση των αντιμικροβιακών στη θεραπευτική από τα μέσα του 20ου αιώνα αποτέλεσε επανάσταση στην αντιμετώπιση των βακτηριακών λοιμώξεων. Όμως, η χρήση και κατάχρηση των αντιβιοτικών είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ανθεκτικών βακτηρίων, με τα ζώα και το περιβάλλον να θεωρούνται ως κύρια δεξαμενή των ανθεκτικών βακτηρίων ή των παραγόντων αντοχής. Ειδικότερα, μεταξύ των παθογόνων βακτηρίων που απομονώνονται από τα ζώα και τα τρόφιμα ζωικής προέλευσης, ανήκουν και τα είδη Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae και Acinetobacter spp., τα οποία σχετίζονται με σοβαρές ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις. Η αντιμετώπιση των λοιμώξεων που προκαλούν έχει ελάχιστες θεραπευτικές επιλογές, καθώς μπορούν να εμφανίσουν αντοχή ακόμα και σε αντιβιοτικά τελευταίας γραμμής, όπως οι καρβαπενέμες. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον για τη δυνατότητα μετάδοσης ανθεκτικών παθογόνων βακτηρίων ή παραγόντων αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες από τα ζώα προς τον άνθρωπο. Οι περισσότεροι ερευνητές προτείνουν ότι οι συγκεκριμένοι παράγοντες μεταδίδονται σε σημαντικό βαθμό, με τα εμπλεκόμενα ζώα να ανήκουν τόσο στα ζώα συντροφιάς όσο και στα παραγωγικά ζώα και τα προϊόντα τους. Από τα παραγωγικά ζώα, τα πτηνά φαίνεται να διαδραματίζουν το σημαντικότερο ρόλο, εξαιτίας της εντατικής εκτροφής τους, των κτηνιατρικών πρακτικών και της εκτεταμένης χρήσης αντιμικροβιακών ουσιών σε αυτά. Αν και υπάρχουν διάφορες μελέτες που αναφέρουν την απομόνωση βακτηρίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά από τα ζώα και τα τρόφιμα, oι δημοσιευμένες έρευνες συνήθως δεν συγκρίνουν τα απομονωθέντα στελέχη από τα ζώα, τα τρόφιμα και τους νοσηλευόμενους ασθενείς. Επιπλέον, οι οδοί μεταφοράς των ανθεκτικών βακτηρίων από τα ζώα, τα τρόφιμα και το περιβάλλον στον άνθρωπο δεν έχουν χαρακτηριστεί εκτενώς, προκειμένου να ελεγχθεί η εμφάνιση και η μετάδοση της μικροβιακής αντοχής μέσω της ζωικής-τροφικής-περιβαλλοντικής-ανθρώπινης αλυσίδας. Κατά συνέπεια, απαιτούνται μελέτες στο πλαίσιο της Ενιαίας Υγείας, που θα αποσαφηνίσουν τη σημασία των τροφίμων και της αλυσίδας παραγωγής κρέατος στη μετάδοση των ανθεκτικών στα αντιβιοτικά βακτηρίων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε σε τέσσερα μέρη. Το πρώτο μέρος αποσκοπεί στην απομόνωση και τον χαρακτηρισμό στελεχών E. coli, K. pneumoniae και Acinetobacter spp. του συμπλέγματος A. calcoaceticus – A. baumannii, που διαθέτουν γενετικά στοιχεία παραγωγής β-λακταμασών (ESBL, AmpC, καρβαπενεμάσες), από σφάγια κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Ειδικότερα, από συνολικά 600 ολόκληρα σφάγια πουλερικών έγινε συλλογή δειγμάτων δέρματος λαιμού. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από ζώα που εκτρέφονταν σε 32 εκτροφές των Περιφερειών Κεντρικής Μακεδονίας και Ηπείρου, καλύπτοντας κάθε εποχή, από τον χειμώνα του 2023 έως τον χειμώνα του 2024. Το δεύτερο μέρος σχετίζεται με την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό στελεχών E. coli, K. pneumoniae και Acinetobacter spp. του συμπλέγματος A. calcoaceticus – A. baumannii, που διαθέτουν γενετικά στοιχεία παραγωγής β-λακταμασών, από ανθρώπους και το περιβάλλον κατά μήκος της αλυσίδας παραγωγής ορνίθειου κρέατος (εκτροφείς, εκδοροσφαγείς, περιβάλλον εκτροφών και πτηνοσφαγείων). Πιο συγκεκριμένα, η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε εποχιακά μεταξύ του χειμώνα 2023 και του φθινοπώρου 2023 σε 12 πτηνοτροφικές μονάδες και δύο σφαγεία που βρίσκονταν στις Περιφέρειες Κεντρικής Μακεδονίας και Ηπείρου. Συνολικά συγκεντρώθηκαν 224 περιβαλλοντικά δείγματα από διάφορα σημεία, εκ των οποίων τα 100 δείγματα προέρχονταν από το περιβάλλον πτηνοτροφείων και τα 124 δείγματα από το περιβάλλον σφαγείων, καθώς και 80 δείγματα από εκτροφείς και εργαζόμενους στο σφαγείο. Το τρίτο μέρος αφορά την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό στελεχών E. coli, K. pneumoniae και Acinetobacter spp. του συμπλέγματος A. calcoaceticus – A. baumannii, που διαθέτουν γενετικά στοιχεία παραγωγής β-λακταμασών, από το ενδονοσοκομειακό περιβάλλον, με έμφαση στα μαγειρεία του νοσοκομείου και τους εργαζόμενους που σχετίζονται με τη σίτιση των ασθενών του. Η δειγματοληψία πραγματοποιούταν κάθε εποχή από την άνοιξη του 2023 έως τον χειμώνα του 2024 σε δύο νοσοκομεία στις Περιφέρειες Κεντρικής Μακεδονίας και Ηπείρου. Συνολικά συλλέχθηκαν 200 δείγματα από διάφορα σημεία του περιβάλλοντος των μαγειρείων των νοσοκομείων, 40 δείγματα στήθους κοτόπουλου και 80 δείγματα από το προσωπικό των μαγειρείων. Το τέταρτο μέρος έχει ως στόχο τη σύγκριση των απομονωθέντων στελεχών E. coli, K. pneumoniae και A. baumannii από το περιβάλλον, τα ζώα, τα τρόφιμα και τον άνθρωπο, στο πλαίσιο της Ενιαίας Υγείας, ενώ επιπλέον προσδιορίστηκαν ο συνολικός επιπολασμός των ανθεκτικών στελεχών και οι πιθανοί παράγοντες που συνέβαλαν στην απομόνωση ανθεκτικών στελεχών από τους εκτροφείς και τους εργαζόμενους σε μαγειρεία νοσοκομείων, διαμέσου ερωτηματολογίων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του πρώτου μέρους της διατριβής, ο επιπολασμός των ανθεκτικών στην κεφταζιδίμη στελεχών E. coli, K. pneumoniae και Acinetobacter spp. στα σφάγια ορνιθίων ήταν 40,8%, 3,3% και 46,7%, αντίστοιχα. Τα ποσοστά απομόνωσης των στελεχών Acinetobacter spp. ήταν σημαντικά μεγαλύτερα στην Περιφέρεια Ηπείρου, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια του χειμώνα. Τα στελέχη E. coli και K. pneumoniae εμφάνισαν αντοχή σε πολυάριθμα αντιβιοτικά, ενώ τα στελέχη Acinetobacter spp. επέδειξαν ευαισθησία σε πολλές από τις εξεταζόμενες κατηγορίες αντιβιοτικών. Ένα στέλεχος K. pneumoniae εμφάνισε επιπρόσθετα αντοχή στην ερταπενέμη. Τα περισσότερα στελέχη E. coli και Acinetobacter spp. ήταν πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά (MDR), ενώ όλα τα στελέχη K. pneumoniae χαρακτηρίστηκαν ως MDR ή εκτεταμένως ανθεκτικά στα αντιβιοτικά (XDR). Όλα τα στελέχη E. coli επιβεβαιώθηκαν φαινοτυπικά ως ESBL/AmpC παραγωγείς, ενώ τα μισά στελέχη K. pneumoniae εμφάνισαν τον ESBL φαινότυπο και τα υπόλοιπα μισά τον ESBL + AmpC φαινότυπο. Τα πιο διαδεδομένα γονίδια αντοχής στα στελέχη E. coli ήταν τα γονίδια blaCTX-M της ομάδας 1 και blaTEM, ενώ στα στελέχη K. pneumoniae ανιχνεύθηκαν τα γονίδια blaSHV, blaCTX-M της ομάδας 1, blaOXA και blaDHA. Σε αντίθεση με την E. coli και την K. pneumoniae, μόνο το 10,2% των στελεχών Acinetobacter spp. έφεραν γονίδια παραγωγής β-λακταμασών και κυρίως τα γονίδια blaCTX-M των ομάδων 1 και 9 και blaTEM. Δεν ανιχνεύτηκαν γονίδια παραγωγής καρβαπενεμασών σε κανένα στέλεχος. Στα δενδρογράμματα κυρίων φασμάτων του MALDI-TOF MS, μικρό επίπεδο απόστασης (distance level) παρατηρήθηκε κυρίως μεταξύ στελεχών που απομονώθηκαν από δείγματα δέρματος λαιμού της ίδιας εκτροφής και εποχής. Ωστόσο, μεγάλου βαθμού συγγένεια παρατηρήθηκε και μεταξύ ορισμένων στελεχών που απομονώθηκαν από διαφορετικές εκτροφές εντός της ίδιας Περιφέρειας ή ακόμη και μεταξύ διαφορετικών Περιφερειών. Oρισμένα στελέχη που απομονώθηκαν κατά τη διάρκεια διαφορετικών εποχών, είτε από τις ίδιες είτε από διαφορετικές εκτροφές και Περιφέρειες, παρουσίασαν επίσης μικρό επίπεδο απόστασης. Τέλος, κατά τη φυλογενετική ανάλυση των στελεχών E. coli, τα περισσότερα στελέχη κατατάχθηκαν στις φυλογενετικές ομάδες Α και Β1. Με βάση τα αποτελέσματα του δεύτερου μέρους της διατριβής, ο επιπολασμός των ανθεκτικών στελεχών E. coli, K. pneumoniae και Acinetobacter spp. στο περιβάλλον εκτροφών είναι 15,0%, 11,0% και 1,0%, αντίστοιχα, ενώ στο περιβάλλον των σφαγείων είναι 57,3%, 1,6% και 25,8%, αντίστοιχα. Η εποχικότητα επηρέασε σημαντικά τα ποσοστά επιπολασμού των στελεχών E. coli στο περιβάλλον των εκτροφών και σφαγείων, με τα περισσότερα στελέχη να απομονώνονται στις εκτροφές το καλοκαίρι και στα σφαγεία την άνοιξη και το καλοκαίρι. Ομοίως, τα ποσοστά επιπολασμού των στελεχών E. coli στο περιβάλλον των εκτροφών ήταν σημαντικά μεγαλύτερα στην Περιφέρεια Κεντρικής Μακεδονίας σε σύγκριση με την Περιφέρεια Ηπείρου. Αναφορικά με τα ανθρώπινα δείγματα, δύο στελέχη A. baumannii απομονώθηκαν από το δέρμα δύο εκτροφέων (16,7%) και ένα στέλεχος E. coli απομονώθηκε από το δέρμα ενός εκτροφέα (8,3%). Τα στελέχη E. coli και K. pneumoniae εμφάνισαν αντοχή σε πολυάριθμα αντιβιοτικά, ενώ τα στελέχη Acinetobacter spp. επέδειξαν γενικώς ευαισθησία σε πολλές από τις εξεταζόμενες κατηγορίες αντιβιοτικών. Όλα τα στελέχη E. coli και K. pneumoniae, καθώς και τα περισσότερα στελέχη Acinetobacter spp., χαρακτηρίστηκαν ως MDR. Όλα τα στελέχη Ε. coli και K. pneumoniae επιβεβαιώθηκαν φαινοτυπικά ως ESBL/AmpC παραγωγείς. Τα ESBL γονίδια που βρέθηκαν συνηθέστερα στα στελέχη E. coli ήταν τα γονίδια blaCTX-M της ομάδας 1, blaTEM και blaSHV. Αντίστοιχα, τα ESBL γονίδια που βρέθηκαν στα στελέχη K. pneumoniae ήταν τα blaCTX-M της ομάδας 1, blaSHV, blaTEM και blaOXA-1-like. Ωστόσο, τα περισσότερα στελέχη Acinetobacter spp. δεν έφεραν τα γονίδια των β-λακταμασών που εξετάστηκαν, με το 24,4% των στελεχών να φέρνουν γονίδια blaCTX-M των ομάδων 1 ή/και 9. Στα δενδρογράμματα κυρίων φασμάτων του MALDI-TOF MS, μεγάλου βαθμού συγγένεια παρατηρήθηκε συχνά μεταξύ στελεχών που προέρχονταν από δείγματα κυρίως των ίδιων, αλλά και διαφορετικών εκτροφών και σφαγείων, εντός της ίδιας Περιφέρειας και εποχής. Επιπλέον, ορισμένα στελέχη από εκτροφές και σφαγεία διαφορετικών Περιφερειών παρουσίασαν μικρό επίπεδο απόστασης (distance level) μεταξύ τους. Ορισμένα στελέχη από το περιβάλλον εκτροφών εμφάνισαν μεγάλο βαθμό συγγένειας με συγκεκριμένα στελέχη από το περιβάλλον σφαγείων, ενώ μικρό επίπεδο απόστασης παρατηρήθηκε και μεταξύ στελεχών που απομονώθηκαν κατά τη διάρκεια διαφορετικών εποχών. Κατά τον προσδιορισμό των φυλογενετικών ομάδων των στελεχών E. coli, τα περισσότερα στελέχη κατατάχθηκαν στις φυλογενετικές ομάδες Α και Β1. Με βάση τα αποτελέσματα των ερωτηματολογίων των εκτροφέων, παρατηρήθηκαν διάφορες κακές πρακτικές και συμπεριφορές όσον αφορά τη χρήση και κατανάλωση αντιβιοτικών, μεταξύ τόσο των θετικών όσο και των αρνητικών για ανθεκτικά στελέχη ανθρώπων και σμηνών κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Τα αποτελέσματα του τρίτου μέρους της διατριβής έδειξαν πως ο επιπολασμός των ανθεκτικών στελεχών E. coli, K. pneumoniae και Acinetobacter spp. στο περιβάλλον των μαγειρείων νοσοκομείων ήταν 4,5%, 1,5%, και 15,0%, αντίστοιχα. Τα στελέχη E. coli και K. pneumoniae ήταν ανθεκτικά στην κεφταζιδίμη και τη μεροπενέμη αντίστοιχα, ενώ επτά από τα 36 ανθεκτικά στελέχη Acinetobacter spp. ήταν ανθεκτικά στη μεροπενέμη. Επιπλέον, από το 35% των δειγμάτων κοτόπουλου απομονώθηκαν 14 ανθεκτικά στην κεφταζιδίμη στελέχη E. coli. Αναφορικά με τα ανθρώπινα δείγματα, δύο στελέχη Acinetobacter spp. απομονώθηκαν από το δέρμα ενός μάγειρα (4% των ανθρώπων). Η εποχικότητα επηρέασε σημαντικά τα ποσοστά επιπολασμού των στελεχών E. coli στο περιβάλλον των μαγειρείων, με τα περισσότερα στελέχη E. coli να απομονώνονται το καλοκαίρι. Ακόμα, ο επιπολασμός των στελεχών Acinetobacter spp. στο περιβάλλον του μαγειρείου ήταν σημαντικά μεγαλύτερος στο νοσοκομείο της Περιφέρειας Κεντρικής Μακεδονίας σε σύγκριση με το νοσοκομείο της Περιφέρειας Ηπείρου. Όσον αφορά τα δείγματα κοτόπουλου, ο επιπολασμός των στελεχών E. coli ήταν σημαντικά μεγαλύτερος στην Περιφέρεια Κεντρικής Μακεδονίας σε σύγκριση με την Περιφέρεια Ηπείρου. Όλα τα στελέχη E. coli ήταν MDR και επιβεβαιώθηκαν φαινοτυπικά ως παραγωγοί ESBL, ενώ τα περισσότερα περιβαλλοντικά και κλινικά στελέχη K. pneumoniae ήταν XDR. Αναφορικά με τα περιβαλλοντικά στελέχη Acinetobacter spp., τα περισσότερα ευαίσθητα στη μεροπενέμη στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως MDR και όλα τα ανθεκτικά στη μεροπενέμη στελέχη ταξινομήθηκαν ως XDR. Το 43,75% των κλινικών στελεχών A. baumannii χαρακτηρίστηκαν ως πανανθεκτικά στελέχη. Το γονίδιο blaCTX-M της ομάδας 1 ήταν το συχνότερα απαντώμενο ESBL γονίδιο στα στελέχη E. coli, με δεύτερο σε συχνότητα το γονίδιο blaSHV. Τα γονίδια blaSHV ήταν τα πιο συχνά απαντώμενα ESBL γονίδια σε περιβαλλοντικά στελέχη K. pneumoniae, ενώ όλα τα περιβαλλοντικά στελέχη K. pneumoniae έφεραν την καρβαπενεμάση KPC. Τα κλινικά στελέχη K. pneumoniae έφεραν περισσότερα γονίδια παραγωγής β-λακταμασών σε σύγκριση με τα περιβαλλοντικά. Όσον αφορά τα στελέχη Acinetobacter spp., μόνο το 6,5% των ευαίσθητων στη μεροπενέμη στελεχών έφεραν γονίδια β-λακταμασών και κυρίως τα γονίδια blaTEM και blaCTX-M των ομάδων 1 ή 2. Ωστόσο, όλα τα ανθεκτικά στη μεροπενέμη περιβαλλοντικά στελέχη Acinetobacter spp. έφεραν γονίδια β-λακταμασών, όπως τα γονίδια blaCTX-M των ομάδων 1 και 9, blaTEM, blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaAIM, blaDIM, blaSIM, blaBIC, blaNDM, blaVIM και blaOXA-48-like. Παρόμοια ευρήματα εντοπίστηκαν και στα κλινικά στελέχη A. baumannii αναφορικά με το γενετικό προφίλ της αντοχής τους. Στα δενδρογράμματα κυρίων φασμάτων του MALDI-TOF MS, παρατηρήθηκε μεγάλου βαθμού συγγένεια μεταξύ των στελεχών που απομονώθηκαν εντός του ίδιου νοσοκομείου και της ίδιας εποχής. Ωστόσο, μικρό επίπεδο απόστασης (distance level) παρατηρήθηκε και μεταξύ στελεχών που απομονώθηκαν από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές και εποχές. Επιπλέον, μικρό επίπεδο απόστασης παρατηρήθηκε μεταξύ συγκεκριμένων περιβαλλοντικών στελεχών και στελεχών από τρόφιμα, καθώς και μεταξύ συγκεκριμένων κλινικών και περιβαλλοντικών στελεχών. Κατά τη φυλογενετική ανάλυση των στελεχών E. coli, τα περισσότερα στελέχη κατατάχθηκαν στις φυλογενετικές ομάδες Α και Β1. Με βάση τα αποτελέσματα των ερωτηματολογίων του προσωπικού των μαγειρείων, παρατηρήθηκαν διάφορες λανθασμένες πρακτικές ως προς τη χρήση και κατανάλωση αντιβιοτικών στους εργαζόμενους, ανεξάρτητα της φορείας ανθεκτικών στα αντιβιοτικά βακτηρίων. Στο τέταρτο μέρος της διατριβής, παρατηρήθηκε μεγάλου βαθμού συγγένεια κυρίως μεταξύ των στελεχών που απομονώθηκαν από παρόμοια ενδιαιτήματα, με βάση τα δενδρογράμματα κυρίων φασμάτων του MALDI-TOF MS. Ωστόσο, μικρό επίπεδο απόστασης (distance level) παρατηρήθηκε και μεταξύ στελεχών που προέρχονταν από διαφορετικά ενδιαιτήματα, όπως μεταξύ στελεχών από σφάγια πουλερικών, εκτροφές, σφαγεία και νοσοκομεία (περιβαλλοντικά και κλινικά στελέχη). Το δενδρόγραμμα PFGE για τις K. pneumoniae αποκάλυψε πέντε παλσότυπους, στους οποίους κατατάσσονται στελέχη με 100% γενετική ομοιότητα, υποδεικνύοντας τη διασπορά μερικών κλώνων στελεχών K. pneumoniae στην εκτροφή και το νοσοκομείο και τη μετάδοση στελεχών K. pneumoniae κατά μήκος της αλυσίδας παραγωγής κρέατος ορνιθίων. Η ανίχνευση 100% γενετικής ομοιότητας μεταξύ ενός στελέχους από σφάγιο ορνιθίων και ενός κλινικού στελέχους αποτελεί ισχυρή ένδειξη ότι ανθεκτικά στελέχη K. pneumoniae μεταδίδονται από τα τρόφιμα στον άνθρωπο. Στα δενδρογράμματα του MALDI-TOF MS και της PFGE παρατηρήθηκε μεγάλου βαθμού συγγένεια τόσο σε στελέχη που απομονώθηκαν από την ίδια περιοχή και εποχή όσο και σε στελέχη που απομονώθηκαν από διαφορετικές Περιφέρειες και εποχές. Όπως υποδείχθηκε και από τα αποτελέσματα της αλληλούχισης (WGS), τα αποτελέσματα των MALDI-TOF MS και PFGE μπορούν να αλληλοσυμπληρώνονται και να χρησιμοποιούνται συνδυαστικά για τη διερεύνηση των συγγενειών στελεχών που προέρχονται από διαφορετικά ενδιαιτήματα. Με βάση τα αποτελέσματα του WGS, τα δύο εξεταζόμενα στελέχη K. pneumoniae ανήκαν στον ίδιο αλλότυπο (ST11), ενώ τα δύο εξεταζόμενα στελέχη A. baumannii ανήκαν σε διαφορετικούς αλλότυπους (ST2 το κλινικό στέλεχος και ST241 το στέλεχος από σφάγιο ορνιθίων). Τα στελέχη K. pneumoniae και A. baumannii έφεραν γονίδια αντοχής για πολυάριθμες κατηγορίες αντιβιοτικών, καθώς και πλασμίδια τύπου Inc και οικογένειας Rep-3, αντίστοιχα. Ο επιπολασμός των στελεχών E. coli και Acinetobacter spp. στο δέρμα των ανθρώπων της κοινότητας ήταν 1,8% και 5,3% αντίστοιχα. Μεταξύ των μεταβλητών των ερωτηματολόγιων, παρατηρήθηκε στατιστικώς μεγαλύτερη πιθανότητα απομόνωσης ανθεκτικών στελεχών από τους άνδρες συγκριτικά με τις γυναίκες. Συμπερασματικά, η παρουσία και διασπορά ανθεκτικών στελεχών E. coli, K. pneumoniae και Acinetobacter spp. κατά μήκος της αλυσίδας παραγωγής κρέατος ορνιθίων είναι σαφής. Η εκλεκτική απομόνωση ανθεκτικών στελεχών με τη χρήση αντιβιοτικών που εφαρμόστηκε, αύξησε τα ποσοστά ανάκτησης των στελεχών από τα εξεταζόμενα δείγματα, παρέχοντας ακριβέστερη εκτίμηση του πραγματικού επιπολασμού των ανθεκτικών βακτηρίων στα διάφορα ενδιαιτήματα. Η ανεύρεση ανθεκτικών κλινικών στελεχών και στελεχών από το κρέας ορνιθίων με πολύ μεγάλο βαθμό συγγένειας αποτελεί σημαντικό ζήτημα Δημόσιας Υγείας που καθιστά τα τρόφιμα δυνητικό μέσο μεταφοράς ανθεκτικών στελεχών ή γονιδίων αντοχής στον άνθρωπο.