Φλεγμονώδεις φαινότυποι σχετιζόμενοι με τη φυσική ανοσία

Abstract

Innate immunity, the first line of defense against pathogenic microorganisms, plays an important role in maintaining homeostasis by triggering phagocytic mechanisms, activating complement and inducing adaptive immunity. However, excessive activation of the innate immune system can lead in the pathogenesis of inflammatory diseases, such as inflammatory bowel diseases (IBD), severe COVID-19 and autoinflammatory disorders. In the everyday clinical practice, the investigation of an inflammatory disease can be challenging. The causes of inflammation may be infectious and non-infectious, such as autoimmune, autoinflammatory and neoplastic, while the differentiation of those causes, is essential to provide individualized treatment. Difficulties in differential diagnosis may lead in indiscriminate use of antibiotics, or even immunomodulatory therapies, resulting in increased morbidity and mortality. Better clarification of the innate immunity related mechanisms that involve in the pathogenesis of inflammation is crucial for the implementation of appropriate therapeutics. Neutrophils, one of the most studied cells in this thesis, are the main effectors of innate immunity. They represent the majority of leukocytes and are the first to aggregate chemotactically at the site of inflammation. Until recently, neutrophils were considered short-lived cells lacking the capacity to differentiate. In recent years, the fundamental mechanisms by which these cells significantly contribute to inflammation, thrombosis, and fibrosis have been increasingly elucidated. Neutrophils are now known to display a marked cellular plasticity. Plasticity is the ability of circulating neutrophils to respond in different environmental stimuli, transcriptionally reprogram themselves and produce bioactive substances, essential for communication with other cell populations, but concomitantly capable of inducing specific inflammatory phenotypes. Neutrophil extracellular traps (NETs) were originally identified as a host defense mechanism against pathogens. Today, they have been recognized as key regulators of neutrophil’s plasticity. Depending on their “coating” with bioactive molecules, they can interact with various cell types, such as endothelial cells and fibroblasts. Fibroblasts are one of the most abundant cell populations of the stroma. Their primary role is maintaining tissue homeostasis by producing the extracellular matrix. Moreover, they can communicate with other cellular systems, including neutrophils, and in turn activate and produce bioactive molecules, such as inflammatory cytokines and tissue factor (TF), that contribute to tissue damage. The main aim of this thesis is to shed light in the innate immunity-related molecular and cellular mechanisms that regulate inflammation in clinical models of inflammatory diseases, such as COVID-19 and Crohn's disease. In Publication 1 (Δ1), we studied the involvement of NETs and IL-6/JAK-1/2/STAT pathway in the inflammatory disease model of severe COVID-19. Patients with severe ARDS who received combined treatment with DNAse I, an agent that dismantles NETs scaffold, Tocilizumab, a monoclonal antibody (mAb) against IL-6 and Baricitinib, a JAK-1/2 inhibitor, were studied retrospectively and compared to patients treated with either the standard of care protocol (SOC), or SOC plus monotherapy with Anakinra, an IL-1 inhibitor, or SOC plus monotherapy with Tocilizumab. Combined treatment (COMBI), was associated with a statistically significant reduction of intubation rate, mortality and hospitalization days, compared to the rest treatment groups. In vitro, plasma obtained by COVID-19 patients, was able to induce the TF/Thrombin pathway in primary pulmonary fibroblasts, while this effect was reversed by the immunomodulatory factors of COMBI, providing a mechanistic explanation of the aforementioned clinical observations. In Publication 2 (Δ2), we explored the mechanisms of neutrophil-fibroblast interaction in Crohn’s disease (CD). Transcriptomic analysis of circulating neutrophils isolated from patients with CD, revealed the interferon signaling pathway, as the most overexpressed pathway. At a functional level, IFNα was able to prime neutrophils to obtain fibrogenic properties through their NETs. Thus, in contrast to ulcerative colitis (UC), CD NETs, were able to induce a fibrotic phenotype in healthy fibroblasts, similar to that observed in primary intestinal CD fibroblasts. Both neutrophil priming by IFNα and fibroblast activation appeared to be dependent to the JAK-1/2/STAT signaling pathway. Moreover, IFNα was found significantly increased in the sera of patients with CD compared to those of patients with UC. Translating our findings, IFNα was found to be positively correlated with the Crohn’s disease activity index (CDAI), opposed to UC. Overall, IFNα, NETs and JAK-1/2/STAT pathway emerged as potential therapeutic targets for CD fibrosis, while IFNα could serve as a diagnostic and prognostic laboratory biomarker of the disease. In conclusion, this thesis offers new insights into the role of innate immunity in inflammatory diseases, such as COVID-19 and Crohn’s disease. It emphasizes the importance of combination therapies that target multiple interdependent pathways and presents promising new therapeutic targets as well as diagnostic/prognostic biomarkers for further research and clinical validation. Additionally, the mechanisms of innate immunity discussed in this thesis could serve as a foundation for research in other models of inflammatory diseases.

Η φυσική ανοσία, η πρώτη γραμμή άμυνας έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών συμβάλλει καθοριστικά στη διατήρηση της ομοιοστασης, πυροδοτώντας φαγοκυτταρικούς μηχανισμούς, ενεργοποιώντας το συμπλήρωμα και θέτοντας το υπόστρωμα για την επαγωγή της ειδικής ανοσίας. Ωστόσο, η υπέρμετρη ενεργοποίηση της φυσικής ανοσίας μπορεί να οδηγήσει στην παθογένεση φλεγμονωδών νοσημάτων όπως τα ιδιοπαθή φλεγμονώδη νοσήματα του εντέρου (ΙΦΝΕ), η σοβαρή νόσος COVID-19 και τα αυτοφλεγμονώδη νοσήματα. Στην καθημερινή κλινική πράξη η διερεύνηση ενός φλεγμονώδους νοσήματος μπορεί να παρουσιάζει δυσκολίες. Τα αίτια της φλεγμονής μπορεί να είναι λοιμώδη αλλά και μη, όπως αυτοάνοσα, αυτοφλεγμονώδη ή νεοπλασματικά, ενώ η διάκριση των αιτιών αυτών είναι απαραίτητη για την εφαρμογή της κατάλληλης εξατομικευμένης θεραπείας. Η δυσχέρεια στη διαφορική διάγνωση συχνά μεταφράζεται σε αλόγιστη χρήση αντιβιοτικών, ή ακόμη και ανοσοτροποιητικών θεραπειών, με αποτέλεσμα την αύξηση της νοσηρότητας και της θνητότητας και διαιώνιση των προβλημάτων του ασθενή. Η διευκρίνηση των μηχανισμών της φυσικής ανοσίας που συμμετέχουν στην παθογένεση της φλεγμονής είναι καίριας σημασίας για την εφαρμογή της ενδεδειγμένης θεραπείας. Τα ουδετερόφιλα, ένα από τα βασικά κύτταρα τα οποία μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή, αποτελούν τους κυριότερους τελεστές της φυσικής ανοσίας. Εκπροσωπούν την πλειονότητα των λευκοκυττάρων και είναι τα πρώτα που συναθροίζονται χημειοτακτικά στις θέσεις της φλεγμονής. Μέχρι πρόσφατα πιστευόταν ότι τα ουδετερόφιλα είναι βραχύβια κύτταρα χωρίς ιδιαίτερες ικανότητες διαφοροποίησης. Τα τελευταία χρόνια ωστόσο, αναδείχθηκαν μηχανισμοί με τους οποίους τα κύτταρα αυτά διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη φλεγμονή, τη θρόμβωση και την ινωτική διαδικασία. Τα ουδετερόφιλα σήμερα είναι γνωστό πως έχουν ιδιαίτερη κυτταρική πλαστικότητα. Πλαστικότητα είναι η ιδιότητα των κυκλοφορόντων ουδετεροφίλων να απαντούν σε διάφορα περιβαλλοντικά ερεθίσματα, να αναπρογραμματίζονται μεταγραφικά και να παράγουν βιοδραστικές ουσίες απαραίτητες για την επικοινωνία με άλλα κυτταρικά συστήματα, αλλά και ικανές να επάγουν ειδικούς φλεγμονώδεις φαινοτύπους. Οι εξωκυττάριες παγίδες των ουδετεροφίλων (Neutrophil Extracellular Traps – NETs) αρχικά αναγνωρίσθηκαν ως ένας μηχανισμός άμυνας των ουδετεροφίλων έναντι των παθογόνων. Σήμερα είναι γνωστό πως αποτελούν λειτουργικό τελεστή της πλαστικότητας των ουδετεροφίλων, δηλαδή δομές που αναλόγως της «επένδυσης» τους με βιοδραστικά μόρια είναι ικανές να αλληλοεπιδρούν με άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς, όπως τα ενδοθηλιακά κύτταρα και οι ινοβλάστες. Οι ινοβλάστες αποτελούν έναν από τους σημαντικότερους κυτταρικούς πληθυσμούς του στρώματος. Πρωτίστως, συμμετέχουν στη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών παράγοντας την εξωκυττάριο μήτρα. Επιπλέον έχουν την ικανότητα να επικοινωνούν με άλλα κυτταρικά συστήματα, όπως αυτό των ουδετεροφίλων και σε απάντηση της συνομιλίας τους να ενεργοποιούνται και να παράγουν βιομόρια υπεύθυνα για την ιστική βλάβη, όπως οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες και ο ιστικός παράγοντας (TF). Κύριος σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να μελετηθούν οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας που ρυθμίζουν τη φλεγμονή σε κλινικά μοντέλα φλεγμονωδών νοσημάτων, όπως η COVID-19 και η νόσος Crohn. Στη Δημοσίευση 1 (Δ1) μελετήθηκε η συμμετοχή των NETs και της οδού IL-6/JAK-1/2/STAT στο φλεγμονώδες μοντέλο της σοβαρής νόσου COVID-19. Εξετάσθηκαν αναδρομικά ασθενείς με σοβαρό ARDS, οι οποίοι έλαβαν συνδυασμένη θεραπεία με DNAse Ι, έναν παράγοντα που καταστρέφει το ικρίωμα των ΝΕΤs, Tocilizumab, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) έναντι της IL-6 και Baricitinib, έναν αναστολέα του JAK-1/2, εν συγκρίσει με ασθενείς ίδιας βαρύτητας οι οποίοι έλαβαν είτε την standard of care θεραπεία (SOC), είτε SOC και μονοθεραπεία με Anakinra, έναν αναστολέα της IL-1, είτε SOC και μονοθεραπεία με Tocilizumab. Η ανωτέρω συνδυαστική θεραπεία (COMBI), σε κλινικό επίπεδο σχετίστηκε με στατιστικά σημαντική μείωση του ποσοστού διασωλήνωσης, θνητότητας και ημερών νοσηλείας συγκριτικά με τις υπόλοιπες ομάδες ελέγχου. In vitro, το πλάσμα των COVID-19 ασθενών ήταν ικανό να επάγει το μονοπάτι TF/θρομβίνη σε πρωτογενείς πνευμονικούς ινοβλάστες, ενώ το φαινόμενο αυτό αναστράφηκε αποτελεσματικά από τους ανοσοτροποποιητικούς παράγοντες της COMBI θεραπείας, παρέχοντας μια μηχανιστική εξήγηση των ανωτέρω κλινικών παρατηρήσεων. Στη Δημοσίευση 2 (Δ2) μελετήθηκαν οι μηχανισμοί της αλληλεπίδρασης των ουδετεροφίλων-ινοβλαστών στο μοντέλο της νόσου Crohn (CD). Η μεταγραφωμική ανάλυση των κυκλοφορούντων ουδετεροφίλων ασθενών με CD, ανέδειξε την υπερέκφραση του μονοπατιού σηματοδότησης των ιντερφερονών, ως το πλέον υπερεκφραζόμενο μονοπάτι στα κύτταρα αυτά. Σε λειτουργικό επίπεδο, η ΙFNα ήταν ικανή να «προετοιμάσει» (priming) τα ουδετερόφιλα ώστε να επάγουν έναν ινωτικό φαινότυπο μέσω των NETs σε υγιείς ινοβλάστες, που ομοιάζει με αυτόν των πρωτογενών CD ινοβλαστών. Τόσο το priming των ουδετεροφίλων από την IFΝα όσο και η ενεργοποίηση των ινοβλαστών φάνηκε να εξαρτάται από το μονοπάτι σηματοδότησης JAK-1/2/STAT. Η IFNα βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στους ορούς των ασθενών με CD σε σχέση με αυτούς των ασθενών με ελκώδη κολίτιδα (UC). Μεταφράζοντας τα αποτελέσματα σε κλινικό επίπεδο, τα επίπεδα της IFNα φάνηκε να συσχετίζονται θετικά με τον δείκτη βαρύτητας της νόσου CDAI, σε αντίθεση με τη νόσο ελέγχου UC. Συνολικά, η IFNα, τα NETs και το μονοπάτι JAK-1/2/STAT αναδείχθηκαν ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι για την ίνωση της CD, ενώ η IFNα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένας διαγνωστικός και προγνωστικός εργαστηριακός βιοδείκτης της νόσου. Συμπερασματικά η διατριβή αυτή προσφέρει νέα δεδομένα για το ρόλο της φυσικής ανοσίας σε μοντέλα φλεγμονωδών νοσημάτων, όπως η COVID-19 και η νόσος Crohn. Αναδεικνύεται η σημασία της εφαρμογής συνδυασμένων θεραπειών που στοχεύουν σε περισσότερα του ενός αλληλεξαρτώμενα μονοπάτια και προσφέρονται νέοι ελκυστικοί θεραπευτικοί στόχοι και διαγνωστικοί/προγνωστικοί βιοδείκτες για περαιτέρω ερευνητική μελέτη και κλινική επιβεβαίωση. Παράλληλα οι μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας που παρουσιάζονται στη διατριβή αυτή μπορούν να αποτελέσουν αντικείμενο έρευνας και σε άλλα φλεγμονώδη μοντέλα νόσου.