Κυτταρικοί και μοριακοί μεσολαβητές στην ανοσοθρόμβωση και στην ανοσοϊνωση

Abstract

Immunothrombosis and immunofibrosis are mechanisms associated with the pathogenesis of a wide range of disorders, including infections, inflammatory, autoimmune, and cardiovascular/metabolic diseases, affecting a large number of patients worldwide. They are functionally linked to common molecular pathways and cellular populations. These mechanisms are characterized by dysregulation or excessive activation of the immune response, leading to acute or chronically prolonged inflammation that triggers the thrombotic and/or fibrotic process, ultimately resulting in damage to target tissues and organs. A key role is played by the interaction between cells of the innate immune system, such as neutrophils and monocytes, with tissue-resident cells, such as fibroblasts and endothelial cells. Additionally, the induction and regulation of these interactions are significantly influenced by bioactive molecular mediators, including neutrophil extracellular traps (NETs), which carry neutrophil-derived proteins/proteases that mediate their actions (e.g., MPO, tissue factor/TF), various complement system proteins (e.g., C3a, C5a), cytokines (e.g., TNF-α, IL-6), chemokines (e.g., IL-8), and growth factors (e.g., TGF-β, PDGF).The interplay between inflammation, thrombosis, and fibrosis through the innate immune system has been a field of extensive research in recent years. However, the underlying functional mechanisms involved in various diseases remain incompletely elucidated. A better understanding of the molecular and cellular mediators and pathways involved is crucial for identifying new diagnostic and/or therapeutic targets in a range of severe inflammatory diseases and complications characterized by increased morbidity and mortality, complex pathophysiology, and clinical heterogeneity. Recent studies by our team have highlighted the critical role of neutrophils and the NETs they release (NETosis) in septic and aseptic inflammation across various clinical disease models. Specifically, despite their structural similarities, research data suggest that "not all NETs are the same," as their protein composition varies in different inflammatory conditions, a fact associated with specific diseases and/or their complications. NETs and their bioactive components can determine the functional plasticity of neutrophils in the microenvironment of each disease, inducing thrombotic and/or fibrotic damage. For instance, neutrophils, through NETosis, release bioactive TF, the primary initiator of the coagulation system, promoting immunothrombosis or even collagen production by vascular endothelium. Additionally, activated neutrophils, through NET release and the proteases they carry (e.g., MPO), acquire a pro-fibrotic role by promoting fibroblast differentiation and activation towards collagen production. Another example is the release of NETs carrying bioactive IL-1β, which characterizes flare-ups of autoinflammatory diseases such as familial Mediterranean fever (FMF), Still's disease, and ulcerative colitis (UC).Taking into account the aforementioned research data, this dissertation studied representative inflammatory clinical models of immunothrombosis and immunofibrosis, aiming to propose new cellular mechanisms and potential molecular targets. The first part of this dissertation focuses on severe COVID-19. Previous studies from our department revealed a novel pathogenic mechanism in COVID-19, identifying NETosis and the complement system as key elements of SARS-CoV-2-induced immunothrombosis. Additionally, our team recently highlighted the significant role of pulmonary fibroblasts in COVID-19-related immunothrombosis, linking the inflammatory environment of the disease to the expression and activity of TF in pulmonary fibroblasts. Clinical data support that the inflammatory response induced by severe COVID-19 in lung tissue is associated with the presence of fibrotic lesions. Building on and expanding these findings, this study investigated the mechanistic relationship between the inflammation caused by severe COVID-19 and the expression of the regulatory transcription factor KLF2 in human pulmonary fibroblasts. Furthermore, the in vitro effect of therapeutic agents used in rescue therapy (COMBI) was studied. These agents target NETs (inhaled DNase), JAK-1/2 kinases (baricitinib), and IL-6 signaling (tocilizumab) in combination, aiming to assess their potential contribution to disease control. The results demonstrate reduced KLF2 expression in pulmonary fibroblasts as a key negative regulator of fibrosis and suggest molecular/cellular mediators as potential targets for addressing immunofibrosis. The study of immunothrombotic and fibrotic mechanisms in severe COVID-19 enabled the expansion of our research into other inflammatory diseases, such as Inflammatory Bowel Disease (IBD), with a focus on Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The second part of this dissertation builds on this prior experience to investigate the IBD model, with an emphasis on the mechanisms linking inflammation to the development of intestinal fibrosis.CD is characterized by chronic relapsing inflammation, which, unlike UC, can lead to fibrotic intestinal strictures and fistulas. Despite advances in diagnosis and treatment, only 50% of patients achieve clinical and endoscopic remission, often requiring surgical intervention. In many cases, assessing disease activity or distinguishing between UC and CD remains challenging. The study focused on the potential mechanistic relationship between KLF2 and CD-associated immunofibrosis, as well as the differential functional plasticity of neutrophils/NETs in the two inflammatory bowel diseases. Simultaneously, the production of the IL-8 chemokine by intestinal fibroblasts sustains their reciprocal interaction with neutrophils. In addition to investigating the mechanisms underlying inflammatory and fibrotic processes, this dissertation also focuses on the development of potential new diagnostic tools to improve the clinical management of inflammatory diseases. The third part involves the development of a novel diagnostic method based on the differential protein composition of NETs in various inflammatory diseases. Previous initial findings from our laboratory suggested that the presence of IL-1β in NETs during inflammatory attacks/active phases of disease is a hallmark of IL-1β-mediated autoinflammatory diseases (AID). Given that circulating extracellular DNA is an established surrogate marker for NETs in the periphery, the method was based on an innovative “in-house” ELISA that quantitatively measures the IL-1β/extracellular DNA complex (IL-1β/cell-free DNA complex) in patient plasma. Analysis of clinically well-characterized plasma samples demonstrated that IL-1β/DNA complex levels could serve as an efficient and accurate tool for the rapid differential diagnosis of fever and acute inflammation between AID and other inflammatory conditions, such as classic autoimmune diseases, bacterial sepsis, and other infections. These preliminary results pave the way for larger, multicenter studies to further validate the diagnostic and prognostic utility of this method. Additionally, the approach could be further refined to incorporate additional protein markers [PRO(tein)/DNA ELISA], enabling its application to a broader range of inflammatory and immunothrombotic disorders where NETosis plays a significant role. Overall, this dissertation investigates molecular and cellular mechanisms linking inflammation, immunothrombosis, and fibrosis across different diseases, while also proposing NET-based diagnostic strategies to improve the clinical management of inflammatory disorders.

Η ανοσοθρόμβωση και η ανοσοίνωση αποτελούν μηχανισμούς που σχετίζονται με την παθογένεια ενός ευρύτατου φάσματος διαταραχών, όπως λοιμώξεις, φλεγμονώδη, αυτοάνοσα και καρδιαγγειακά/μεταβολικά νοσήματα, επηρεάζοντας ένα μεγάλο αριθμό ασθενών παγκοσμίως. Συνδέονται λειτουργικά με κοινά μοριακά μονοπάτια και κυτταρικούς πληθυσμούς. Χαρακτηρίζονται από απορρύθμιση ή υπέρμετρη ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης που οδηγεί σε οξεία ή χρόνια παρατεταμένη φλεγμονή με αποτέλεσμα την πυροδότηση της θρομβωτικής ή/και ινωτικής διαδικασίας και τελικά την βλάβη των ιστών και οργάνων στόχων. Καθοριστικό ρόλο διαδραματίζει η συνομιλία των κυττάρων της έμφυτης/φυσικής ανοσίας, όπως τα ουδετερόφιλα και τα μονοκύτταρα, με ιστικά κύτταρα, όπως οι ινοβλάστες και το ενδοθήλιο. Επιπλέον, στην επαγωγή και ρύθμιση των παραπάνω αλληλεπιδράσεων είναι σημαντικός ο ρόλος βιοδραστικών μοριακών μεσολαβητών, όπως οι εξωκυττάριες παγίδες χρωματίνης των ουδετεροφίλων (NETs) τα οποία φέρουν πρωτεΐνες/πρωτεάσες των ουδετεροφίλων μέσω των οποίων ασκείται η δράση τους (π.χ. MPO, ιστικός παράγοντας/TF), διάφορες πρωτεΐνες του συστήματος του συμπληρώματος (π.χ. C3α, C5α), κυτταροκίνες (π.χ. TNF-α, IL-6), χημειοτακτικοί (π.χ. IL-8) και αυξητικοί παράγοντες (π.χ. TGF-β, PDGF). Η συνομιλία φλεγμονής-θρόμβωσης-ίνωσης μέσω του συστήματος της έμφυτης ανοσίας, αποτελούν πεδίο εκτεταμένης έρευνας τα τελευταία χρόνια, ωστόσο οι υποκείμενοι λειτουργικοί μηχανισμοί που συμμετέχουν στα διάφορα νοσήματα δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένοι. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών και κυτταρικών μεσολαβητών και οδών που εμπλέκονται είναι σημαντική για την ανάδειξη νέων διαγνωστικών ή/και θεραπευτικών στόχων σε μια σειρά σοβαρών φλεγμονωδών νοσημάτων και επιπλοκών που χαρακτηρίζονται από αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα, σύνθετη παθοφυσιολογία, και κλινική ετερογένεια.Πρόσφατες μελέτες της ομάδας μας ανέδειξαν τον καθοριστικό ρόλο των ουδετεροφίλων και των ΝΕΤs που απελευθερώνουν (ΝΕΤωση), στην σηπτική και άσηπτη φλεγμονή, σε διάφορα κλινικά μοντέλα νόσων. Πιο συγκεκριμένα, παρά τις δομικές ομοιότητες τους, ερευνητικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι «όλα τα NETs δεν είναι ίδια» μια και η πρωτεϊνική τους σύσταση διαφέρει στις επιμέρους φλεγμονώδεις καταστάσεις και το γεγονός αυτό σχετίζεται με συγκεκριμένες νόσους ή/και τις επιπλοκές τους. Τα ΝΕΤs και τα βιοενεργά συστατικά τους δύναται να καθορίζουν την λειτουργική πλαστικότητα των ουδετεροφίλων στο μικροπεριβάλλον της κάθε νόσου, επάγοντας την θρομβωτική ή/και ινωτική βλάβη. Π.χ. τα ουδετερόφιλα, μέσω της ΝΕΤωσης, απελευθερώνουν βιοενεργό TF που αποτελεί τον βασικό εκκινητή του συστήματος πήξης, επάγοντας την ανοσοθρόμβωση ή ακόμη και την παραγωγή κολλαγόνου από το ενδοθήλιο των αγγείων. Επιπλέον, τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα, μέσω της απελευθέρωσης NETs και των πρωτεασών που μεταφέρουν (π.χ. MPO), αποκτούν προ-ινωτικό ρόλο, προάγοντας την διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των ινοβλαστών προς παραγωγή κολλαγόνου. Άλλο παράδειγμα αποτελεί η απελευθέρωση ΝΕΤs που φέρουν βιοδραστική IL-1β και χαρακτηρίζουν τις κρίσεις αυτοφλεγμονωδών νοσημάτων όπως ο οικογενής μεσογειακός πυρετός (FMF), η νόσος του Still και η ελκώδης κολίτιδα (UC). Λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω ερευνητικά δεδομένα, στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν τυπικά φλεγμονώδη κλινικά μοντέλα ανοσοθρόμβωσης και ανοσοίνωσης με στόχο να προταθούν νέοι κυτταρικοί μηχανισμοί και υποψήφιοι μοριακοί στόχοι. To πρώτο σκέλος της διατριβής αφορά την σοβαρή COVID-19. Προηγούμενες μελέτες του τμήματός μας αποκάλυψαν ένα νέο παθογενετικό μηχανισμό στην COVID-19 προτείνοντας την ΝΕΤωση και το σύστημα του συμπληρώματος ως βασικά στοιχεία της SARS-CoV-2 επαγόμενης ανοσοθρόμβωσης. Επιπλέον, πρόσφατα η ομάδα μας ανέδειξε τον σημαντικό ρόλο των πνευμονικών ινοβλαστών στην ανοσοθρόμβωση της COVID-19, συνδέοντας το φλεγμονώδες περιβάλλον της νόσου με την έκφραση και δραστικότητα του TF στους πνευμονικούς ινοβλάστες. Κλινικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι η φλεγμονώδης απόκριση που επάγει η σοβαρή COVID-19 στον πνευμονικό ιστό, συνδέεται με την παρουσία ινωτικών βλαβών. Λαμβάνοντας υπόψη και επεκτείνοντας όλα τα παραπάνω, διερευνήθηκε η ύπαρξη μηχανιστικής σχέσης μεταξύ της φλεγμονής που προκαλείται από την σοβαρή COVID-19, και της έκφρασης του ρυθμιστικού μεταγραφικού παράγοντα KLF2 σε ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε in vitro η επίδραση θεραπευτικών παραγόντων που χρησιμοποιήθηκαν στη θεραπεία διάσωσης (COMBI), οι οποίοι στοχεύουν συνδυαστικά τα NETs (εισπνεόμενη DNase), τις κινάσες JAK-1/2 (baricitinib) και τη σηματοδότηση της IL-6 (tocilizumab), με σκοπό την αξιολόγηση της πιθανής συμβολής τους στον έλεγχο της νόσου. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν την αυξημένη έκφραση του KLF2 στους πνευμονικούς ινοβλάστες, ως αρνητικό ρυθμιστή της ίνωσης και προτείνουν μοριακούς/κυτταρικούς μεσολαβητές στόχευσης στην ανοσοίνωση. Η μελέτη των ανοσοθρομβωτικών και ινωτικών μηχανισμών στη σοβαρή COVID-19 επέτρεψε την επέκταση της έρευνάς μας σε άλλες φλεγμονώδεις παθήσεις, όπως οι Ιδιοπαθείς Φλεγμονώδεις Νόσοι του Εντέρου (IBD), με έμφαση στη νόσο του Crohn (CD) και την ελκώδη κολίτιδα (UC). Το δεύτερο σκέλος της διατριβής αξιοποιεί αυτή την πρότερη εμπειρία προκειμένου να μελετηθεί το μοντέλο της IBD, με εστίαση στους μηχανισμούς που συνδέουν τη φλεγμονή με την ανάπτυξη εντερικής ίνωσης. Η CD χαρακτηρίζεται από χρόνια υποτροπιάζουσα φλεγμονή, η οποία, σε αντίθεση με την UC, μπορεί να οδηγήσει σε ινώδεις στενώσεις του εντέρου και συρίγγια. Παρά τις προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία, μόνο το 50% των ασθενών επιτυγχάνουν κλινική και ενδοσκοπική ύφεση, ενώ συχνά οδηγούνται στο χειρουργείο. Σε αρκετές περιπτώσεις η εκτίμηση της δραστηριότητας της νόσου ή η διάκριση μεταξύ UC & CD είναι προβληματική. Η μελέτη επικεντρώθηκε στην πιθανή μηχανιστική σχέση του KLF2 με την ίνωση της CD και στην διαφορετική λειτουργική πλαστικότητα των ουδετεροφίλων/ΝΕΤs στις δύο IBD. Παράλληλα, η παραγωγή του χημειοτακτικού παράγοντα IL-8 από τους εντερικούς ινοβλάστες διατηρεί την αμοιβαία αλληλεπίδρασή τους με τα ουδετερόφιλα. Εκτός από τη μελέτη των μηχανισμών που διέπουν τις φλεγμονώδεις και ινωτικές διεργασίες, η διατριβή εστιάζει και στην ανάπτυξη νέων πιθανών διαγνωστικών εργαλείων για τη βελτίωση της κλινικής διαχείρισης των φλεγμονωδών νοσημάτων. Το τρίτο σκέλος αφορά την ανάπτυξη μιας πρότυπης διαγνωστικής μεθόδου που βασίζεται στη διαφορετική πρωτεϊνική σύσταση των ΝΕΤs στα διάφορα φλεγμονώδη νοσήματα. Αξιοποιήθηκαν παλαιότερα, αρχικά, δεδομένα του εργαστηρίου μας που προτείνουν ως χαρακτηριστικό των IL-1β διαμεσολαβούμενων αυτοφλεγμονωδών νοσημάτων (AID, IL-1β-mediated autoinflammatory diseases) τον εντοπισμό της IL-1β στα NETs κατά τις φλεγμονώδεις προσβολές/ενεργές φάσεις της νόσου. Δεδομένου ότι το κυκλοφορούν εξωκυττάριο DNA αποτελεί ένα καθιερωμένο υποκατάστατο δείκτη των NETs στην περιφέρεια, η μέθοδος βασίστηκε σε πρωτότυπη “in-house” ELISA που μετράει ποσοτικά το σύμπλεγμα IL-1β/εξωκυτταρίου DNA (IL-1β/cell free DNA complex) στο πλάσμα των ασθενών. Σε καλά κλινικά χαρακτηρισμένα δείγματα πλάσματος φάνηκε ότι τα επίπεδα του συμπλέγματος IL-1β/DNA μπορούν να αποτελέσουν ένα εύχρηστο και ακριβές εργαλείο, για την ταχεία διαφορική διάγνωση του πυρετού και της οξείας φλεγμονής μεταξύ των AID και άλλων φλεγμονωδών νοσημάτων, όπως κλασικά αυτοάνοσα νοσήματα, βακτηριδιακή σήψη και άλλες λοιμώξεις. Τα αρχικά αυτά αποτελέσματα ανοίγουν το δρόμο σε μεγαλύτερης κλίμακας, πολυκεντρικές, μελέτες, για την περαιτέρω επικύρωση της διαγνωστικής/προγνωστικής χρησιμότητας της μεθόδου. Επιπλέον, η μέθοδος μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω αποτελώντας την βάση για την ενσωμάτωση περισσότερων πρωτεϊνικών δεικτών [PRO(tein)/DNA ELISA] καλύπτοντας ένα ευρύ φάσμα διάγνωσης φλεγμονωδών, ή/και ανοσοθρομβωτικών διαταραχών στα οποία η ΝΕΤωση είναι σημαντική. Συνολικά, η διατριβή διερευνά μοριακούς και κυτταρικούς μηχανισμούς που συνδέουν τη φλεγμονή, την ανοσοθρόμβωση και την ίνωση σε διαφορετικά νοσήματα, ενώ παράλληλα προτείνει διαγνωστικές στρατηγικές που βασίζονται στα ΝΕΤs για τη βελτίωση της κλινικής διαχείρισης φλεγμονωδών διαταραχών.