Διερεύνηση του ρόλου των πρωτεϊνών της υπεροικογένειας Geminin στον κυτταρικό κύκλο και στη διαφοροποίηση

Abstract

Multicellular organisms maintain a balance between proliferation and differentiation by coordinating the elements that regulate both processes. The Geminin superfamily of proteins, consisting of Geminin, McIdas and GemC1, are involved in both DNA replication and centrosome duplication and in the differentiation of multicellular cells. In this study, we addressed the regulation of McIdas during the cell cycle, including the G0 phase, and the consequences of its dysregulation for genome integrity. In this thesis, using time-lapse microscopy in live cells, we found that McIdas levels decrease after anaphase and increase again in the G1 phase. McIdas is known from previous studies in our laboratory to be a substrate of the APC/C complex and is recognized through two destruction sequences: a D box and an ABBA motif. Here, by studying mutants of McIdas for its APC/C recognition sequences that render McIdas non-degradable upon mitosis, we found that its non-degradable forms led to genomic instability phenotypes such as chromatin bridges remaining in G1 phase after mitosis, micronuclei, multinuclear cells and 53BP1 nuclear bodies. Resolution of chromatin bridges occurs at mitosis by activation of the abscission checkpoint at mitosis. If they are not resolved, they can lead to the other phenotypes described above. Therefore, it would be worth investigating whether McIdas plays a role in resolving chromatin bridges in mitosis. At the same time, the role of McIdas in the G0 phase and specifically in the formation of the primary cilium was investigated. The primary cilium is an organelle of microtubules that protrudes from the cell surface and is mainly formed when the cell is in G0. It is immobile and acts as an antenna, transmitting signals to the cell. We observed that silencing McIdas significantly reduces the number of cells in G0 that form a primary cilium. Next, we wanted to determine the stage of ciliogenesis at which McIdas acts. In the present study, silencing McIdas did not affect the maturation of the basal body, nor did it affect the ability of Golgi-derived vesicles to form around the basal body. Knowing from previous studies that the ability of the cell to make primary cilium in the absence of McIdas is also unaffected, it is very likely that the basal body migration to the cell membrane is impeded. At the same time, we found that silencing McIdas disrupts both the actin cytoskeleton and the microtubules of the cell. Because the cytoskeleton plays an important role in basal body migration, it is possible that McIdas affects this stage of ciliogenesis through the cytoskeleton. Finally, a preliminary study of McIdas levels in cancer tissues was performed. We used data from the TCGA database and found that McIdas mRNA levels are not affected in tissues from 33 cancer types compared to their normal tissue counterparts. However, in three specific cancers, higher levels of McIdas are associated with poor patient survival. However, these data need to be investigated experimentally to determine any effect of McIdas on the survival of patients with specific cancer types. McIdas affects several key cell cycle processes, such as DNA replication, centrosome duplication, mitosis, primary cilium formation, and differentiation of multinucleated cells. The members of the Geminin superfamily are involved in a variety of cellular processes. Clarifying their roles will allow understanding how they may contribute to the balance between proliferation and differentiation.

Οι πολυκύτταροι οργανισμοί διατηρούν την ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης μέσω του συντονισμού των στοιχείων που ρυθμίζουν και τις δύο διαδικασίες. Η υπεροικογένεια πρωτεϊνών Geminin, που αποτελείται από τις Geminin, McIdas και GemC1 εμπλέκονται τόσο στην αντιγραφή του DNA και στο διπλασιασμό των κεντροσωματίων όσο και στη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, ασχοληθήκαμε με τη ρύθμιση της McIdas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένης της φάσης G0, και τις συνέπειες της απορρύθμισής της για την ακεραιότητα του γονιδιώματος. Στην παρούσα διατριβή με τη χρήση μικροσκοπίας time-lapse σε ζωντανά κύτταρα διαπιστώθηκε πως τα επίπεδα της McIdas μειώνονται μετά την ανάφαση και αυξάνονται ξανά στη φάση G1. Η McIdas είναι γνωστό και από προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου πως αποτελεί υπόστρωμα του συμπλόκου APC/C και αναγνωρίζεται μέσω δύο αλληλουχιών καταστροφής: ένα D Box και ένα μοτίβο ABBA. Εδώ, μελετώντας μεταλλάγματα της McIdas, για τις αλληλουχίες αναγνώρισης της από το APC/C, που καθιστούν την McIdas μη αποικοδομήσιμη κατά τη μίτωση, διαπιστώθηκε πως οι μη αποικοδομήσιμες μορφές της οδήγησαν σε φαινοτύπους γονιδιωματικής αστάθειας, όπως γέφυρες χρωματίνης που παραμένουν στη φάση G1 μετά τη μίτωση, μικροπυρήνες, πολυπύρηνα κύτταρα και πυρηνικά σωμάτια 53BP1. Η επίλυση των γεφυρών χρωματίνης πραγματοποιείται στη μίτωση με την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου αποκοπής στη μίτωση (abscission checkpoint). Εάν αυτές δεν επιλυθούν, μπορούν να οδηγήσουν στους υπόλοιπους φαινοτύπους που περιγράφονται παραπάνω. Συνεπώς, θα άξιζε να διερευνηθεί κατά πόσο η McIdas παίζει κάποιο ρόλο στην επίλυση των χρωματινικών γεφυρών στη μίτωση. Παράλληλα, διερευνήθηκε ο ρόλος της McIdas στη φάση G0 και συγκεκριμένα στον σχηματισμό του πρωτογενούς κροσσού. Ο πρωτογενής κροσσός είναι ένα οργανίδιο από μικροσωληνίσκους που προεξέχει από την επιφάνεια του κυττάρου και σχηματίζεται κυρίως όταν το κύτταρο βρίσκεται σε G0. Είναι ακίνητος και λειτουργεί ως μια κεραία, μεταδίδοντας σήματα στο κύτταρο. Παρατηρήσαμε πως η αποσιώπηση της McIdas μειώνει σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων στην G0 που σχηματίζουν πρωτογενή κροσσό. Στη συνέχεια, θελήσαμε να προσδιορίσουμε το στάδιο της κροσσογένεσης στο οποίο δρα η McIdas. Στην παρούσα μελέτη, κατά την αποσιώπηση της McIdas δεν επηρεάστηκε η ωρίμανση του βασικού σωματίου, ούτε και η ικανότητα των κυστιδίων Golgi να σχηματίζονται γύρω από το βασικό σωμάτιο. Γνωρίζοντας από προηγούμενες μελέτες πως και η ικανότητα του κυττάρου να κατασκευάζει πρωτογενή κροσσό απουσία της McIdas δεν επηρεάζεται, είναι πολύ πιθανό το στάδιο της μετανάστευσης των βασικών σωματίων προς την κυτταρική μεμβράνη να παρεμποδίζεται. Παράλληλα, διαπιστώσαμε πως η αποσιώπηση της McIdas διαταράσσει τόσο τον κυτταροσκελετό ακτίνης όσο και τους μικροσωληνίσκους του κυττάρου. Επειδή, ο κυτταροσκελετός διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των βασικών σωματίων, είναι πιθανών η McIdas να επηρεάζει αυτό το στάδιο της κροσσογένεσης μέσω του κυτταροσκελετού. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μια προκαταρκτική μελέτη των επιπέδων της McIdas σε καρκινικούς ιστούς. Χρησιμοποιήσαμε δεδομένα από τη βάση δεδομένων TCGA και διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα mRNA της McIdas δεν επηρεάζονται σε ιστούς από 33 τύπους καρκίνου συγκριτικά με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς. Ωστόσο, σε τρεις συγκεκριμένους καρκίνους, υψηλότερα επίπεδα της McIdas συνδέονται με χαμηλή επιβίωση των ασθενών. Τα δεδομένα αυτά όμως πρέπει να διερευνηθούν και πειραματικά για να διαπιστωθεί τυχόν επίδραση της McIdas στη βιωσιμότητα ασθενών με συγκεκριμένους τύπους καρκίνου. Η McIdas επηρεάζει αρκετές βασικές διεργασίες του κυτταρικού κύκλου, όπως η αντιγραφή του DNA, ο διπλασιασμός των κεντροσωματίων, η μίτωση, ο σχηματισμός του πρωτογενούς κροσσού, καθώς και η διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων. Είναι σαφές ότι τα μέλη της υπεροικογένειας Geminin συμμετέχουν σε ποικίλες κυτταρικές διεργασίες. Η αποσαφήνιση των ρόλων τους θα επιτρέψει να κατανοηθεί πώς μπορούν να συμβάλλουν στην ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης.