The role of Lck inhibition on lymphocyte function

Abstract

The Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase Lck, a member of the evolutionarily conserved family of Src kinases (SFKs), is predominantly expressed in T cell and is responsible for the differentiation, proliferation, and activation of T cells, because of its vital role in the initiation of T cell receptor (TCR) signaling following engagement with an antigen. Based on its essential role in these cells, Lck is implicated in aberrant T-cell responses such as autoimmunity, leukemias, allograft rejections and Graft Versus Host Disease as well as the occurrence of toxicity accompanying immunotherapy using Chimeric Antigen Receptor (CAR)- T cells. As a result, Lck has become a highly attractive target for the development of small molecule inhibitors. However, designing these inhibitors has been exceptionally challenging, as currently available compounds exhibit very low target specificity. The primary obstacle is the remarkable homology shared among SFK members within their catalytic centers, which makes the development of selective inhibitors exceedingly difficult. Recent studies from our laboratory and others have identified an N-terminal regulatory domain (LcKSH4) located outside the catalytic center, as mandatory for Lck anchoring on plasma membrane and its activity. Importantly, LckSH4 displays negligible homology with other members of the SFK family or any other kinases, making it a perfect target for selective Lck inhibition. The goal of the current study is the efficient and highly selective inhibition of Lck by blocking the LckSH4 domain, which in turn will prohibit anchoring of the kinase at the plasma membrane and decrease its enzymatic activity. The LckSH4 blocking will be accomplished using nanobodies (anti-LckSH4 Nbs). Nbs are single-domain antibody fragments derived from heavy chain-only antibodies (HcAbs) which are naturally found in camelids. Nbs consist of one single variable heavy chain (VHH) region, which is the site of epitope binding. In recent years Nbs have been characterized as the “rising stars” of the antibody world, occupying a central position in cutting-edge applied medical research, particularly in the field of diagnosis and treatment of diseases. Due to their unique structural features and advantageous properties, Nbs are expected to quickly replace conventional monoclonal antibodies as therapeutic and diagnostic tools. 30 different anti-LckSH4 Nbs were tested for their ability to bind Lck intracellularly. Initial data revealed that the Nbs predominantly localized to intracellular compartments different from those of Lck, preventing effective binding. To address this, we introduced various N-terminal modifications to the Nbs with the aim to enforce their colocalization with Lck, thereby increasing the likelihood of successful Lck binding. To select the top Nb Lck-binder, we assessed whether the N-terminal modifications successfully directed the Nbs to the same intracellular compartments as Lck, as well as their ability to bind Lck in different cell lines (HEK293 and Jurkat). Additionally, we evaluated the capacity of these Nbs to interfere with Lck activation and block Lck-mediated TCR signaling. While the majority of N-terminal modifications successfully directed the Nbs to the same compartments as Lck, only one modification—the addition of the LckSH4 domain to NbGT, termed Lck-NbGT—resulted in significant Lck binding. The other modifications exhibited minimal or no binding. Importantly, Lck-NbGT was specific for Lck, as it failed to bind chimeric forms of Lck in which the LckSH4 domain had been replaced by those of other SFK members, and it did not interfere with signaling in B cell lines, in which another SFK member-Lyn is expressed. Although, our initial working hypothesis that Nb-mediated masking of LckSH4 will abolish Lck enzymatic activity, could not been proved, we identified a specific and efficient Lck binder, which we then employed for the selective knock down of the kinase. Specifically, we repurposed the usage of Lck-NbGT as a mediator for Lck degradation using the proteasome system. Lck-NbGT was fused with the ubiquitin E3 ligase RNF4, with the purpose to bind and lead Lck to ubiquitin proteasome-mediated destruction. This fusion showed promising results since endogenous Lck expression levels were significantly reduced. Additionally, collective data from confocal microscopy and co-immunoprecipitation experiments revealed that NbGT can be used as a non-invasive, specific and high resolution Lck probe, able to pinpoint native Lck with high accuracy. Based on these data, we propose the broader usage of Nbs as a new biochemical tool to determine the intracellular localisation of target molecules with superior resolution than the one provided by imaging techniques.

Η ειδική λεμφοκυτταρική τυροσινική κινάση-Lck είναι μέλος της εξελικτικά συντηρημένης οικογένειας των Src κινασών (SFK) και εκφράζεται κυρίως στα Τ λεμφοκύτταρα. Η Lck είναι υπεύθυνη για την διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, λόγω του καίριου ρόλου της στην επαγωγή της Τ κυτταρικής σηματοδότησης μετά την πρόσδεση ενός αντιγόνου από τον Τ κυτταρικό υποδοχέα που έχουν στην επιφάνεια τους. Βασιζόμενη στο ουσιαστικό ρόλο που έχει στα κύτταρα αυτά, η Lck εμπλέκεται σε ποικίλες Τ παρεκτρεπόμενες αποκρίσεις, όπως είναι η αυτοανοσία, οι λευχαιμίες, η νόσος μοσχεύματος έναντι του ξενιστή και στην εμφάνιση τοξικότητας από ανοσοθεραπείες που χρησιμοποιούν CAR-T λεμφοκύτταρα. Λόγω της σημασίας που έχει η Lck στα Τ λεμφοκύτταρα, η κινάση αυτή έχει αποτελέσει ελκυστικό στόχο για την ανάπτυξη μικρών μορίων αναστολέων. Ωστόσο ο σχεδιασμός τέτοιων αναστολέων είναι εξαιρετικά δύσκολος, καθώς οι μέχρι τώρα διαθέσιμοι αναστολείς έχουν ιδιαίτερα χαμηλή ειδικότητα. Το κύριο εμπόδιο είναι η αξιοσημείωτη ομολογία που παρουσιάζουν οι Src κινάσες στα καταλυτικά τους κέντρα, κάνοντας την δημιουργία ειδικών Lck αναστολέων εξαιρετικά απαιτητική. Πρόσφατες έρευνες από το δικό μας και άλλα εργαστήρια έχουν εντοπίσει ότι η SH4 περιοχή της Lck (LckSH4), η οποία βρίσκεται εκτός του καταλυτικού κέντρου της κινάσης, είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση της Lck στην πλασματική μεμβράνη των Τ λεμφοκυττάρων, πρόσδεση η οποία είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της κινάσης. Αξιοσημείωτο είναι επίσης το γεγονός ότι η LckSH4 περιοχή παρουσιάζει ελάχιστη ομολογία με αντίστοιχες περιοχές άλλων Src κινασών, κάνοντας την ιδανικό στόχο για την επιλεκτική αναστολή της Lck. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η αποτελεσματική και επιλεκτική αναστολή της Lck, στοχεύοντας την LckSH4 περιοχή με σκοπό την παρεμπόδιση της αγκυροβόλησης της Lck στην πλασματική μεμβράνη των κυττάρων και κατά συνέπειά την μείωση της ενζυμικής ενεργότητας της κινάσης. Η στόχευση αυτή θα επιτευχθεί με την χρήση νανοαντισωμάτων έναντι της LckSH4 περιοχής (anti-LckSH4 Nbs). Τα νανοαντισώματα (Nbs) είναι μια ειδική κατηγορία μικρών, γενετικά τροποποιημένων αντισωμάτων που απαντώνται στα καμηλοειδή και αποτελούνται αποκλειστικά από μία μεταβλητή περιοχή βαριάς αλύσου (VHH), περιοχή η οποία είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση σε ένα επίτοπο. Τα τελευταία χρόνια τα Nbs έχουν χαρακτηριστεί ως «ανερχόμενα αστέρια» στο κόσμο των αντισωμάτων, κατέχοντας κεντρική θέση στην καινοτόμα εφαρμοσμένη βιοϊατρική έρευνα και ιδιαίτερα στο τομέα της διάγνωσης και της θεραπείας ασθενειών. Λόγω των μοναδικών δομικών χαρακτηριστικών και ιδιοτήτων τους, τα Nbs αναμένονται να αντικαταστήσουν γρήγορα τα συμβατικά μονοκλωνικά αντισώματα ως θεραπευτικά και διαγνωστικά εργαλεία. Στην παρούσα μελέτη 30 διαφορετικά anti-LckSH4 Nbs δοκιμάστηκαν για την ικανότητα τους να προσδέσουν την Lck ενδοκυτταρικά. Τα αρχικά αποτελέσματα έδειξαν ότι τα Nbs εντοπίζονταν κυρίως σε ενδοκυττάρια διαμερίσματα διαφορετικά από αυτά που βρίσκεται η Lck, αποτρέποντας την αποτελεσματική πρόσδεση της Lck από τα Nbs. Προκειμένου να αντιμετωπίσουμε αυτό το πρόβλημα, εισαγάγαμε διάφορες τροποποιήσεις στο αμινοτελικό άκρο των Nbs, με στόχο να αυξηθεί ο συνεντοπισμός μεταξύ της κινάσης και των Nbs, αυξάνοντας με την σειρά του τις πιθανότητες επιτυχούς δέσμευσης της Lck. Η επιλογή του καλύτερου Nb ως δεσμευτή της Lck, έγινε κατόπιν ελέγχου της ικανότητας των αμινοτελικών τροποποιήσεων να κατευθύνουν τα Nbs στα ίδια ενδοκυττάρια διαμερίσματα με την Lck καθώς και της ικανότητας των Nbs να προσδένουν την Lck. Επιπρόσθετα, αξιολογήθηκε η ικανότητα των Nbs να μειώνουν την ενεργότητα της κινάσης και να αναστέλλουν την Lck-επαγόμενη Τ κυτταρική σηματοδότηση. Παρά το γεγονός ότι η πλειοψηφία των αμινοτελικών τροποποιήσεων κατηύθυνε τα Nbs στα ίδια ενδοκυττάρια διαμερίσματα στα οποία βρίσκεται η Lck, μόνο μία τροποποίηση, η προσθήκη της SH4 περιοχής της Lck στο NbGT (Lck-NbGT) οδήγησε στην αποτελεσματική πρόσδεση της Lck. Σε αντίθεση, οι άλλες τροποποιήσεις στα Nbs παρουσίασαν ελάχιστη έως μηδαμινή πρόσδεση στην κινάση. Παράλληλα, το Lck-NbGT είναι ιδιαίτερα επιλεκτικό έναντι της Lck, καθώς δεν είχε την ικανότητα πρόσδεσης χιμαιρικών μορφών της Lck, στις οποίες η LckSH4 αντικαταστάθηκε από τις αντίστοιχες άλλων Src κινασών, ούτε παρεμπόδισε την επαγωγή της ενδοκυττάριας σηματοδότησης στα Β λεμφοκύτταρα, τα οποία εκφράζουν ενδογενώς μια άλλη Src κινάση, την Lyn και όχι την Lck. Παρόλο που η αρχική υπόθεση εργασίας, δηλαδή η στόχευση της LckSH4 περιοχής από τα Nbs θα απωλέσει την ενζυμική ενεργότητα της κινάσης, δεν μπόρεσε να επαληθευτεί, έγινε δυνατή η έρευση ενός αποτελεσματικού και ειδικού προσδέτη της LCK, ο οποίος στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τη επιλεκτική αποικοδόμηση της κινάσης. Πιο συγκεκριμένα, επαναπροσδιορίσαμε την χρήση του Lck-NbGT ως επαγωγέα αποικοδόμησης της Lck, χρησιμοποιώντας το σύστημα του πρωτεασώματος. Πιο αναλυτικά, το Lck-NbGT ενώθηκε με τη Ε3 λιγάση ουβικουιτίνης RNF4, με σκοπό την πρόσδεση της Lck από το Lck-NbGT και την αποικοδόμηση της από το πρωτεάσωμα. Αυτό το καινούργιο είδος anti-LckSH4 Nb έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα, καθώς η μείωση των επιπέδων της Lck ήταν ιδιαίτερα σημαντική. Τέλος, συγκεντρωτικά δεδομένα από συνεστιακή μικροσκοπία και πειράματα ανοσοκατακρίμνισης κατέδειξαν ότι το NbGT μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ειδικός, μη επεμβατικός και υψηλής ανάλυσης ανιχνευτής της Lck, ικανός να εντοπίζει την φυσική τοποθεσία της κινάσης με υψηλή ακρίβεια. Με βάση αυτά τα δεδομένα, προτείνουμε την ευρύτερη χρήση των Nbs ως ένα νέο βιοχημικό εργαλείο για τον προσδιορισμό του ενδοκυτταρικού εντοπισμού των μορίων-στόχων με ανώτερη ανάλυση από αυτή που παρέχεται από τις συμβατικές τεχνικές απεικόνισης.