Ανάπτυξη και εφαρμογή χημειομετρικών μεθοδολογιών για την άμεση και αποτελεσματική ταυτοποίηση βιοδραστικών φυσικών προϊόντων σε φυτικά εκχυλίσματα

Abstract

The identification and isolation of bioactive compounds from complex natural product mixtures remains a significant challenge in natural products research. Conventional isolation methods are time consuming, costly, and often result in the isolation of moderately active compounds, or the detection of already known natural products. A fast and cost-effective way to identify bioactive metabolites in plant extracts prior to isolation has been developed based on NMR-HeteroCovariance approach (NMR-HetCA). In order to evaluate in depth the application of this chemometrics based drug discovery methodology, simple mixtures of 10 standard natural products simulating a Fast Centrifugal Partition Chromatography (FCPC) fractionation (artificial fractions, ArtFrct) were initially prepared. This procedure allowed us to overcome possible issues caused by the chromatographic process and to test the NMR-HetCA method in controlled conditions. The inhibitory activity of the ArtFrct against DPPH was evaluated and their chemical profile was recorded using NMR spectroscopy. Spectral information was processed in the MATLAB environment and HetCA and STOCSY were applied to identify the bioactive compounds. Total heterocovariance plots (pseudo-spectra) facilitated the detection of highly correlated with the bioactivity metabolites and led to the direct identification of the majority of the bioactive compounds, with one false negative result due to its limited solubility during NMR samples preparation. These encouraging results prompted us to further test and validate the NMR-HetCA method in a more complex mixture. Thus, a custom-made mixture of 59 natural standard substances simulating a crude plant extract (artificial extract, ArtExtr) was prepared. FCPC was employed for the fractionation of the ArtExtr, while the inhibitory activity of all fractions against DPPH and tyrosinase was evaluated and their chemical profile was recorded using NMR spectroscopy. Total HetCA plots facilitated the detection and the direct identification of the 52.6% of the active compounds in the case of DPPH. The success in identifying the ArtExtr bioactive substances raised to 63.2% when spectral alignment was implemented. Regarding the tyrosinase study, the success rate of the method was 75%. HetCA incorporates chromatographic (fractionation), spectroscopic (NMR profiling) and bioactivity results along with advanced chemometrics and could be established as a method of choice for the rapid and effective identification of bioactive natural products in plant extracts prior to isolation. In parallel with the NMR-HetCA study of the ArtExtr, a similar study using High-Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) was conducted. HPTLC is widely utilized in natural products research due to its simplicity, low cost and short total analysis time, including data treatment. While HPTLC-bioautography can be used for the rapid identification of bioactive compounds in extracts, the number of available bioautographic methods is limited mainly due to the high cost and difficulty in developing protocols that lead to accurate and reproducible results compared to the corresponding in vitro bioassays. For this reason, an alternative method for the identification of bioactive compounds in plant extracts prior to their isolation using HPTLC combined with multivariate chemometrics was previously explored by our lab. To evaluate this method and compare it to other chemometrics based methods, the case study of the ArtExtr was used. The fractions’ chemical profiles were recorded using HPTLC and two different software were compared for the conversion of the HPTLC chromatograms into densitograms. Multivariate statistics and HetCA were employed and compared, with the success rate in identifying the ArtExtr bioactive substances being 85.7% via sparse heterocovariance (sHetCA) for the DPPH study and 66.7% for the tyrosinase study. HPTLC combined with sHetCA can serve as a valuable tool for the annotation of bioactive compounds in complex mixtures when HPTLC-bioautography is not feasible.Finally, in the last chapter of this thesis, a comprehensive protocol, named “Pegasus”, is introduced for the detection and identification of bioactive compounds in complex natural extracts prior to their isolation. The Pegasus protocol combines the NMR-HetCA method, HPTLC and chemometric techniques to efficiently detect and identify bioactive compounds in an unknown natural extract. In our proof-of-concept study, we evaluated the ArtExtr for the identification of compounds active against DPPH and tyrosinase. The ArtExtr was treated as an unknown extract and statistical approaches, including HetCA, sHetCA, STOCSY and SHY were applied to the spectral, chromatographic, and bioactivity information to identify the highly correlated bioactive compounds. The success rate of this protocol was the detection of 89.5% of the bioactive metabolites and the correct identification of 82.3% of them for the DPPH study, as well as the detection of 87.5% of the bioactive metabolites and the correct identification of 75% of them for the tyrosinase study, while rejecting the majority of the false positive results. The combination of NMR and HPTLC with HetCA provides a robust and sensitive approach for the identification of active ingredients. The proposed methodology addresses the challenges associated with the metabolite profiling of complex natural mixtures and offers a streamlined workflow for the discovery of novel bioactive compounds.

Η ταυτοποίηση και απομόνωση βιοδραστικών ενώσεων από σύνθετα μείγματα φυσικών προϊόντων αποτελεί μια σημαντική πρόκληση στην έρευνα φυσικών προϊόντων. Οι συμβατικές μέθοδοι απομόνωσης είναι χρονοβόρες, δαπανηρές και συχνά οδηγούν στην απομόνωση μέτρια δραστικών ενώσεων ή στην ανίχνευση ήδη γνωστών φυσικών προϊόντων. Μια ταχύτερη και οικονομικότερη μέθοδος ταυτοποίησης βιοδραστικών μεταβολιτών σε φυτικά εκχυλίσματα πριν την απομόνωσή τους έχει αναπτυχθεί με βάση την προσέγγιση NMR-HeteroCovariance (NMR-HetCA). Για να αξιολογηθεί σε βάθος η εφαρμογή αυτής της βασισμένης στη χημειομετρία μεθοδολογίας, αρχικά προετοιμάστηκαν απλά μείγματα 10 πρότυπων φυσικών προϊόντων που προσομοιώνουν τη διαδικασία κλασμάτωσης με Χρωματογραφία Κατανομής με Φυγοκέντριση (FCPC) (τεχνητά κλάσματα, ArtFrct). Αυτή η διαδικασία μας επέτρεψε να ξεπεράσουμε πιθανά ζητήματα που προκαλούνται από τη χρωματογραφική διαδικασία και να δοκιμάσουμε τη μέθοδο NMR-HetCA σε ελεγχόμενες συνθήκες. Η ανασταλτική δράση των ArtFrct έναντι του DPPH αξιολογήθηκε και το χημικό τους προφίλ καταγράφηκε με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR. Οι φασματικές πληροφορίες επεξεργάστηκαν στο περιβάλλον MATLAB και εφαρμόστηκαν οι τεχνικές HetCA και STOCSY για την ταυτοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων. Τα διαγράμματα Ολικού HetCA (ψευδοφάσματα) διευκόλυναν την ανίχνευση έντονα συσχετισμένων με τη δράση μεταβολιτών και οδήγησαν στην άμεση ταυτοποίηση της πλειονότητας των βιοδραστικών ενώσεων, με ένα ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα λόγω της περιορισμένης διαλυτότητάς του κατά την προετοιμασία των δειγμάτων NMR. Αυτά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα μας ώθησαν να δοκιμάσουμε περαιτέρω και να επικυρώσουμε τη μέθοδο NMR-HetCA σε ένα πιο πολύπλοκο μείγμα. Έτσι, δημιουργήθηκε ένα τεχνητό μείγμα 59 πρότυπων φυσικών ουσιών που προσομοιώνει ένα φυτικό εκχύλισμα (τεχνητό εκχύλισμα, ArtExtr). Η χρωματογραφία FCPC χρησιμοποιήθηκε για την κλασμάτωση του ArtExtr, ενώ αξιολογήθηκε η ανασταλτική δράση όλων των κλασμάτων έναντι του DPPH και της τυροσινάσης, και το χημικό τους προφίλ καταγράφηκε με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR. Τα ψευδοφάσματα Ολικού HetCA διευκόλυναν την ανίχνευση και την άμεση ταυτοποίηση του 52.6% των δραστικών ενώσεων στην περίπτωση του DPPH. Η επιτυχία στην ταυτοποίηση των βιοδραστικών ουσιών του ArtExtr αυξήθηκε στο 63.2% όταν εφαρμόστηκε φασματική ευθυγράμμιση. Στη μελέτη για την τυροσινάση, το ποσοστό επιτυχίας της μεθόδου ήταν 75%. Η προσέγγιση HetCA ενσωματώνει χρωματογραφικά (κλασμάτωση), φασματοσκοπικά (προφίλ NMR) και βιοδραστικά δεδομένα, καθώς και προηγμένες χημειομετρικές αναλύσεις και μπορεί να καθιερωθεί ως μέθοδος επιλογής για την ταχεία και αποτελεσματική ταυτοποίηση βιοδραστικών φυσικών προϊόντων σε φυτικά εκχυλίσματα πριν την απομόνωσή τους. Παράλληλα με τη μελέτη NMR-HetCA του ArtExtr, πραγματοποιήθηκε μια παρόμοια μελέτη χρησιμοποιώντας Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας Υψηλής Απόδοσης (HPTLC). Η HPTLC χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα φυσικών προϊόντων λόγω της απλότητάς της, του χαμηλού κόστους και του σύντομου συνολικού χρόνου ανάλυσης, συμπεριλαμβανομένης της επεξεργασίας δεδομένων. Ενώ η HPTLC-βιοαυτογραφία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταχεία ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων σε εκχυλίσματα, ο αριθμός των διαθέσιμων βιοαυτογραφικών μεθόδων είναι περιορισμένος, κυρίως λόγω του υψηλού κόστους και της δυσκολίας ανάπτυξης πρωτοκόλλων που παρέχουν ακριβή και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα σε σύγκριση με τις αντίστοιχες in vitro βιοδοκιμές. Για αυτόν τον λόγο, μια εναλλακτική μέθοδος ταυτοποίησης βιοδραστικών ενώσεων σε φυτικά εκχυλίσματα πριν την απομόνωσή τους, χρησιμοποιώντας HPTLC σε συνδυασμό με πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση, είχε προηγουμένως διερευνηθεί από το εργαστήριό μας. Για την αξιολόγηση αυτής της μεθόδου και τη σύγκρισή της με άλλες χημειομετρικές μεθόδους, χρησιμοποιήθηκε η περίπτωση μελέτης του ArtExtr. Τα χημικά προφίλ των κλασμάτων καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας HPTLC και συγκρίθηκαν δύο διαφορετικά λογισμικά για τη μετατροπή των χρωματογραφημάτων HPTLC σε πυκνογραφήματα. Χρησιμοποιήθηκαν και συγκρίθηκαν η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση και η μέθοδος HetCA, με το ποσοστό επιτυχίας στην ταυτοποίηση των βιοδραστικών ουσιών του ArtExtr να φτάνει το 85.7% μέσω της σποραδικής ετεροδιακύμανσης (sHetCA) για τη μελέτη του DPPH και το 66.7% για τη μελέτη της τυροσινάσης. Η HPTLC σε συνδυασμό με τη μέθοδο sHetCA μπορεί να αποτελέσει πολύτιμο εργαλείο για την αναγνώριση βιοδραστικών ενώσεων σε σύνθετα μείγματα όταν η HPTLC-βιοαυτογραφία δεν είναι εφικτή. Τέλος, στο τελευταίο κεφάλαιο αυτής της διατριβής, παρουσιάζεται ένα ολοκληρωμένο πρωτόκολλο, με την ονομασία "Πήγασος", για την ανίχνευση και ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων σε σύνθετα φυσικά εκχυλίσματα πριν την απομόνωσή τους. Το πρωτόκολλο Πήγασος συνδυάζει τη μέθοδο NMR-HetCA, τη χρωματογραφία HPTLC και χημειομετρικές τεχνικές για την αποτελεσματική ανίχνευση και ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων σε ένα άγνωστο φυσικό εκχύλισμα. Στην μελέτη εφικτότητας της καινοτόμου αυτής ιδέας, αξιολογήθηκε το ArtExtr για την ταυτοποίηση δραστικών ενώσεων έναντι του DPPH και της τυροσινάσης. Το ArtExtr αντιμετωπίστηκε ως άγνωστο εκχύλισμα και εφαρμόστηκαν στατιστικές προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένων των HetCA, sHetCA, STOCSY και SHY, στις φασματικές, χρωματογραφικές και βιοδραστικές πληροφορίες για την ταυτοποίηση των έντονα συσχετισμένων βιοδραστικών ενώσεων. Το ποσοστό επιτυχίας αυτού του πρωτοκόλλου ήταν η ανίχνευση του 89.5% των βιοδραστικών μεταβολιτών και η σωστή ταυτοποίηση του 82.3% αυτών για τη μελέτη του DPPH, καθώς και η ανίχνευση του 87.5% των βιοδραστικών μεταβολιτών και η σωστή ταυτοποίηση του 75% αυτών για τη μελέτη της τυροσινάσης, απορρίπτοντας την πλειονότητα των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Ο συνδυασμός NMR και HPTLC με τη μέθοδο HetCA προσφέρει μια αξιόπιστη και ευαίσθητη προσέγγιση για την ταυτοποίηση δραστικών συστατικών. Η προτεινόμενη μεθοδολογία αντιμετωπίζει τις προκλήσεις που σχετίζονται με την ανάλυση των μεταβολιτών σε σύνθετα φυσικά μείγματα και προσφέρει μια απλοποιημένη διαδικασία για την ανακάλυψη νέων βιοδραστικών ενώσεων.