Δομική και λειτουργική ανάλυση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-2α και μελέτη του ρόλου τους στην προσαρμογή των κυττάρων στην έλλειψη οξυγόνου

Abstract

The main transcription factors regulating cellular responses to low oxygen availability, hypoxia, are hypoxia-induced factors (HIFs), which are heterodimers, with an oxygen-regulated α subunit. In the HIF family, HIF-2 belongs, which is involved in angiogenesis and metastasis and is regulated independently of oxygen and through interaction with other proteins. Here, we reveal a new interaction of HIF-2α with Ataxin-10. In this thesis, we demonstrated that the interaction of HIF-2α with Ataxin-10 increases the transcriptional activity of HIF-2 in hypoxic conditions in cervical cancer and glioblastoma cell lines by enhancing the binding of HIF-2α to chromatin in the hypoxia response elements of SERPINE1, CITED-2 and SOD-2 gene promoters. In addition, this interaction enhances migration and the formation of solid spheroids. These findings establish a new role for Ataxin-10 and highlight that the interaction between HIF-2α and Ataxin-10 represents a novel mechanism for regulating HIF-2. In addition, the structural features of the carboxyterminal end of HIF-2α were studied, which contains the N-transcriptional activation territory, the territory of oxygen-dependent degradation and a part of the inhibitory territory. An effective protocol for the isolation of pure protein of region 366-704 of human protein of HIF-2α was developed, and analysis of biophysical characteristics by circular dichroism spectroscopy showed that 366-704 region of HIF-2α forms an antiparallel beta sheet configuration, and a computational model of the HIF-2α structure was produced. These new data provide us with the structural basis for the unique biological properties of HIF-2.

Οι κύριοι παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν τις κυτταρικές αποκρίσεις στην χαμηλή διαθεσιμότητα οξυγόνου, την υποξία, είναι οι παράγοντες που επάγονται από την υποξία (HIFs), οι οποίοι είναι ετεροδιμερή, με μια α υπομονάδα ρυθμιζόμενη από το οξυγόνο. Στην οικογένεια των HIF, ανήκει ο HIF-2, ο οποίος εμπλέκεται την αγγειογένεση και τη μετάσταση και ρυθμίζεται ανεξάρτητα από το οξυγόνο και μέσω αλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αποκαλύπτουμε μια νέα αλληλεπίδραση του HIF-2α με την Ataxin-10. Η αλληλεπίδραση αυτή αυξάνει τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-2 σε συνθήκες υποξίας σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και γλοιοβλαστώματος, μέσω της ενίσχυσης της δέσμευσης του HIF-2α στη χρωματίνη στα στοιχεία απόκρισης υποξίας των υποκινητών των γονιδίων SERPINE1, CITED-2 και SOD-2. Επίσης, η αλληλεπίδραση αυτή ενισχύει τη μετανάστευση και τον σχηματισμό συμπαγών σφαιροειδών. Τα ευρήματα αυτά καθιερώνουν έναν νέο ρόλο για το Ataxin-10 και υπογραμμίζουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ του HIF-2α και της Ataxin-10 αντιπροσωπεύει έναν νέο μηχανισμό ρύθμισης του HIF-2. Επιπλέον, μελετήθηκαν τα δομικά χαρακτηριστικά του καρβοξυτελικού άκρου του HIF-2α, στο οποίο περιέχεται η επικράτεια Ν-μεταγραφικής ενεργοποίησης, η επικράτεια της εξαρτώμενης από το οξυγόνο αποικοδόμησης και ένα μέρος της ανασταλτικής επικράτειας. Αναπτύχθηκε ένα αποτελεσματικό πρωτόκολλο για την απομόνωση καθαρής πρωτεΐνης της περιοχής 366-704 της ανθρώπινης πρωτεΐνης του HIF-2α και η ανάλυση των βιοφυσικών χαρακτηριστικών με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού έδειξαν ότι η πρωτεΐνη της περιοχής 366-704 του HIF-2α σχηματίζει δομή αντιπαράλληλης β-πτύχωσης. Τα αποτελέσματα του κυκλικού διχρωισμού χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενός μοντέλου της τρισδιάστατης δομής του HIF-2α. Τα νέα αυτά δεδομένα μας προσφέρουν μια δομική βάση για τις μοναδικές βιολογικές ιδιότητες του HIF-2.