Προκλινική διερεύνηση αντιμικροβιακής δράσης μελιού σε πολυανθεκτικούς μικροοργανισμούς και εκτίμηση της ανοσοτροποποιητικής δράσης του σε συνθήκες ενδοτοξιναιμίας-σήψης

Abstract

Antimicrobial resistance is an increasing threat to public health, while the development of new antimicrobials lags behind the evolutionary mechanisms of resistance developed by microorganisms. Honey has emerged as an alternative therapy with a range of nutritional and therapeutic properties, attracting considerable interest from the scientific community. In particular, Manuka honey is renowned for its antimicrobial activity and is classified as "medical-grade honey," with applications in modern medical practice, such as in the treatment of surgical wounds. Despite the growing number of studies, many mechanisms of honey's antimicrobial action remain unknown, which seems to be a multifactorial process. Although there is an abundance of research on honey’s antimicrobial properties, most studies have focused on Gram-positive bacteria, with fewer investigating its action against Gram-negative bacteria. The rising resistance of Gram-negative bacteria, combined with the slow progress in developing new antibiotics for carbapenemase-producing bacteria, is exacerbated by the rapid evolution of the carbapenemases themselves. This challenge highlights the importance and urgency of the research topic investigated in this dissertation. The first part of the dissertation includes a bibliometric analysis, marking the first time that honey's antimicrobial action has been studied using this method. The literature review and bibliometric analysis form essential stages of our dissertation, offering a comprehensive overview of the current knowledge on honey's antimicrobial properties and suggesting potential directions for future research. This novel bibliometric analysis contributes to the expansion of scientific knowledge, while the bibliometric indicators in this research outline the scientific output regarding the antimicrobial and antioxidant properties of honey. The next phase of the dissertation involved investigating the in vitro antimicrobial activity of 47 Greek honeys from different botanical origins, collected from beekeepers in various geographical regions of Greece, against Gram-negative bacteria. The antibacterial properties of honey are attributed to various physicochemical factors, such as acidity, osmotic action, high sugar concentration, as well as the presence of bactericidal compounds like hydrogen peroxide (H₂O₂), antioxidants, and enzymes such as lysozyme, polyphenols, and flavonoids. In our study, we included four genotypically confirmed carbapenemase-positive clinical strains: (1) Pseudomonas aeruginosa producing VIM, (2) Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae producing KPC, (3) Enterobacter cloacae subsp. dissolvens producing VIM, and (4) K. pneumoniae subsp. pneumoniae producing VIM. These strains were isolated from blood cultures of hospitalized patients in tertiary care university hospitals in Attica, Greece, and belong to the Bacterial Collection of the Department of Microbiology at the National and Kapodistrian University of Athens Medical School. Manuka honey was chosen as a positive control, and artificial honey was prepared as a negative control. The antimicrobial activity of the honeys was evaluated using five dilutions (75%, 50%, 25%, 12.5%, and 6.25%) against the four multidrug-resistant clinical strains with the disk diffusion method, and the minimum inhibitory concentrations (MIC) were further determined after the addition of catalase and proteinase K to evaluate the roles of H₂O₂ and peptides in the antimicrobial activity. Our results demonstrated that the antimicrobial activity was closely related to the type of honey, the evaluation method, the dilution, and the microorganism. Arbutus honey exhibited the highest antimicrobial activity against E. cloacae subsp. dissolvens at a 75% concentration, while fir honey was more effective against the same bacterium at a 25% concentration. Several Greek honeys in our study outperformed Manuka honey, especially at lower concentrations. It is noteworthy that, in the disk diffusion method, no statistically significant differences (one way ANOVA, p < 0.005) were observed between the four multidrug-resistant microorganisms across the various types and concentrations of honey, indicating that the destructive effect on bacterial cells was similar regardless of the species or bacterial strain. Thus, honey demonstrates its antimicrobial activity regardless of the microorganism, suggesting a nonspecific mechanism. However, there are significant chemical differences in composition among the various types of honey due to their different topographical and botanical origins. Sepsis is the leading cause of death from infection, with higher mortality in infections caused by multidrug-resistant bacteria. Given that sepsis results from uncontrolled inflammation, we examined the effect of honey as an anti-inflammatory agent in sepsis and polymicrobial peritonitis models in mice. Endotoxins from Gram-negative bacteria, such as lipopolysaccharide (LPS), rapidly induce severe and systemic immune responses that can mimic the early clinical signs of sepsis. Endotoxemia is associated with manifestations such as cytokine storms and multiple organ failure, including liver failure. In our study, we used a mouse model of LPS-induced endotoxemia-sepsis and a model of CS (Cecal Slurry)-induced peritonitis. Manuka honey was used as a positive control, and saline as a negative control. Our results revealed that all examined Greek honeys had anti-inflammatory properties, suppressing the induction of pro-inflammatory mediators TNFα and iNOS in response to LPS stimulation. TNF-α and IL-6 impair liver detoxification ability, leading to dysfunction. Liver function was assessed by measuring the expression of CYP enzymes, which detoxify and eliminate harmful substances resulting from inflammation. LPS significantly reduced CYP expression. Reduced CYP activity leads to decreased metabolism and excretion of toxic metabolites, resulting in their accumulation and toxic effects. The administration of fir and chestnut honey increased the expression of CYP enzymes in the liver of LPS-treated mice, suggesting a potential antioxidant effect. Bacterial load was assessed in the blood, peritoneal lavage, and tissues of the mice subjected to CS. No difference in bacterial load was found in the blood or peritoneal lavage between the CS-treated groups. However, lower bacterial counts were observed in the spleen and lung tissues of the honey-treated mice. Significantly lower bacterial counts were found in the liver of septic mice treated with chestnut and fir honey, compared to the CS-only group. Reduced bacterial counts were also observed in the lungs of CS-treated mice that received arbutus, fir, or Manuka honey. The final part of the thesis concerned the use of sequencing methods to identify and compare bacteria and fungi in various honey samples. The aim of this process was to examine the possible influence of microbial diversity on the induction of antimicrobial activity. Through this approach, we sought to better understand the microbial communities coexisting in honey and assess their role in enhancing honey’s antimicrobial properties. In our study, we found that Lactobacillus predominates in fir honey, with the population of Lactobacillus being higher in fir honey compared to fir-oak honey. Overall, the findings indicate that honey could be a promising complementary treatment, not only as an antimicrobial agent but also as an immunomodulator in the treatment of infections. This study paves new ways for utilizing honey’s natural properties in the development of new antibiotics, which are especially important in an era of rapidly increasing antimicrobial resistance.

Η Μικροβιακή Αντοχή αποτελεί αυξανόμενη απειλή για την Δημόσια Υγεία, ενώ παράλληλα η ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών καθυστερεί σε σχέση με τους εξελικτικούς μηχανισμούς αντοχής που αναπτύσσουν οι μικροοργανισμοί. Το μέλι εμφανίζεται ως εναλλακτική θεραπεία με πολλαπλές θρεπτικές και θεραπευτικές ιδιότητες, κάτι που έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. Το μέλι Manuka μάλιστα, είναι γνωστό για την αντιμικροβιακή του δράση και έχει μάλιστα χαρακτηριστεί ως «μέλι ιατρικής ποιότητας» με εφαρμογές στην σύγχρονη ιατρική πράξη όπως σε χειρουργικά τραύματα. Παρά τον αυξανόμενο αριθμό μελετών, παραμένουν άγνωστοι πολλοί από τους μηχανισμούς της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού, που φαίνεται να είναι πολυπαραγοντική διαδικασία. Αν και υπάρχει πληθώρα ερευνών για την αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού, οι περισσότερες έχουν επικεντρωθεί στα Gram-θετικά βακτήρια με λιγότερες έρευνες να εξετάζουν τη δράση του μελιού έναντι των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η αυξανόμενη ανθεκτικότητα των Gram-αρνητικών βακτηρίων, σε συνδυασμό με την αργή πρόοδο στην έρευνα και ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών για την αντιμετώπιση των βακτηρίων που παράγουν καρβαπενεμάσες, διακυβεύεται από την ταχεία εξέλιξη των ιδίων των καρβαπενεμασών. Αυτή η πρόκληση υπογραμμίζει τη σπουδαιότητα και αναγκαιότητα του ερευνητικού θέματος που διερευνάται σε αυτή τη διδακτορική διατριβή.Το πρώτο μέρος της διατριβής περιλαμβάνει βιβλιομετρική ανάλυση κι αξίζει να αναφερθεί πως είναι η πρώτη φορά που το θέμα της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού εξετάζεται μέσω αυτής της μεθόδου. Η ανασκόπηση της βιβλιογραφίας και η βιβλιομετρική ανάλυση αποτελούν βασικά στάδια στη διατριβή μας, παρέχοντας μια συνολική εικόνα της υφιστάμενης γνώσης γύρω από το αντικείμενο της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού και προτείνοντας πιθανές κατευθύνσεις για μελλοντική έρευνα. Αυτή η μοναδική βιβλιογραφική ανάλυση στο συγκεκριμένο αντικείμενο, συμβάλλει στην διεύρυνση της επιστημονικής γνώσης, ενώ οι βιβλιομετρικοί δείκτες της παρούσας έρευνας σκιαγραφούν την ερευνητική παραγωγή γύρω από τις αντιμικροβιακές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες του μελιού. Επόμενο βήμα της διατριβής ήταν να διερευνήσει την in vitro αντιμικροβιακή δράση ελληνικών μελιών (Ν=47) διαφορετικής βοτανικης προέλευσης που συλλέχθηκαν από μελισσοκόμους διαφορετικών γεωγραφικών περιοχών της Ελλάδας, έναντι Gram αρνητικών βακτηρίων. Οι αντιβακτηριακές ιδιότητες του μελιού έχουν αποδοθεί σε διάφορους φυσικοχημικούς παράγοντες, όπως η οξύτητα, η οσμωτική δράση και η υψηλή συγκέντρωση σακχάρων, αλλά και στην παρουσία βακτηριοκτόνων ενώσεων όπως το Η2Ο2, διάφορα αντιοξειδωτικά και ένζυμα, όπως η λυσοζύμη, οι πολυφαινόλες και τα φλαβονοειδή. Στη μελέτη μας, εντάξαμε τέσσερα γονοτυπικά επιβεβαιωμένα θετικά στην καρβαπενεμάση κλινικά στελέχη: (1) Pseudomonas aeruginosa που παράγει VIM, (2) Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae που παράγει KPC, (3) Enterobacter cloacae subsp. dissolvens που παράγει που παράγει VIM (4) K. pneumoniae. subsp. pneumoniae που παράγει VIM. Αυτά τα στελέχη απομονώθηκαν από αιμοκαλλιέργειες νοσηλευόμενων ασθενών Πανεπιστημιακών Νοσοκομείων Τριτοβάθμιας Περίθαλψης της Αττικής (Ελλάδα) και ανήκουν στη Βακτηριακή Συλλογή του Τμήματος Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Το μέλι Manuka επελέγη ως θετικός μάρτυρας και παρασκευάσαμε ένα τεχνητό μέλι ως αρνητικό μάρτυρα. Η αντιμικροβιακή δράση των εξεταζόμενων μελιών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας πέντε αραιώσεις (75%, 50%, 25%, 12,5% και 6,25%) έναντι των τεσσάρων πολυανθεκτικών κλινικών στελεχών με τη μέθοδο διάχυσης σε δίσκους και προσδιορίστηκαν επιπλέον οι MIC (ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις) μετά από προσθήκη καταλάσης και πρωτεινάσης Κ ώστε ν’αξιολογηθεί ο ρόλος του Η2Ο2 και των πεπτιδίων στην αντιμικροβιακή δράση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν πως η αντιμικροβιακή δράση ήταν στενά συνδεδεμένη με τον τύπο του μελιού, την μέθοδο αξιολόγησης, την αραίωση και τον μικροοργανισμό. Το μέλι κουμαριάς παρουσίασε υψηλότερη αντιμικροβιακή δράση έναντι των E. cloacae subsp. dissolvens στη συγκέντρωση 75%, ενώ το μέλι ελάτης ήταν πιο βακτηριοκτόνο για το ίδιο βακτήριο στη συγκέντρωση 25%. Αρκετά ελληνικά μέλια στη μελέτη μας υπερτερούσαν σε σχέση με το μέλι Manuka, ειδικά σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Είναι αξιοσημείωτο ότι, στη μέθοδο διάχυσης σε δίσκους, δεν εντοπίστηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (μονόδρομη ANOVA για p < 0,005) μεταξύ των τεσσάρων πολυανθεκτικών μικροοργανισμών για τους διάφορους τύπους μελιού και για τις διάφορες συγκεντρώσεις, γεγονός που εξηγεί ότι η καταστροφική επίδραση στα βακτηριακά κύτταρα ήταν η ίδια ανεξάρτητα από το είδος ή το βακτηριακό στέλεχος. Επομένως, το μέλι εκδηλώνει την αντιμικροβιακή του δράση ανεξάρτητα από τον μικροοργανισμό, υποδηλώνοντας μια μη ειδική δράση. Από την άλλη πλευρά υπάρχουν σημαντικές χημικές διαφορές στη σύνθεση μεταξύ των διάφορων τύπων μελιού λόγω της διαφορετικής τοπογραφικής και βοτανικής προέλευσης. Η σήψη είναι το κυριότερο αίτιο θανάτου από λοίμωξη, με αυξημένη θνητότητα στις λοιμώξεις από πολυανθεκτικά βακτήρια και καθώς αυτή προκαλείται από ανεξέλεγκτη λειτουργία των μηχανισμών φλεγμονής, εξετάσαμε την επίδραση του μελιού ως αντιφλεγμονώδους παράγοντα σε μοντέλα σήψης και πολυμικροβιακής περιτονίτιδας ποντικών. Η ενδοτοξίνη από Gram-αρνητικά βακτήρια, όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), επάγει ταχέως σοβαρές και συστηματικές ανοσολογικές αποκρίσεις που μπορούν να μιμηθούν τα αρχικά κλινικά χαρακτηριστικά της σήψης. Η ενδοτοξιναιμία σχετίζεται με εκδηλώσεις όπως καταιγίδα κυτταροκινών (cytokine storm) και ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων, συμπεριλαμβανομένου του ήπατος. Στην μελέτη μας, χρησιμοποιήθηκε ένα ζωικό μοντέλο ενδοτοξιναιμίας-σηψης ποντικών με LPS κι ένα μοντέλο περιτονίτιδας που προκαλείται κατόπιν Cecal Slurry (CS). Το μέλι Manuka χρησιμοποιήιηκε ως θετικός μάρτυρας και αλατούχο διάλυμα ως αρνητικός μάρτυρας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι όλα τα δείγματα ελληνικού μελιού που εξετάστηκαν είχαν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες καταστέλλοντας την επαγωγή των προφλεγμονωδών μεσολαβητών TNFα και iNOS ως απόκριση στη διέγερση LPS. Ο TNF-α και η IL-6 μειώνουν την ικανότητα βιομετατροπής του ήπατος, οδηγώντας σε δυσλειτουργία του. Η ηπατική λειτουργία αξιολογήθηκε με τη μέτρηση της έκφρασης των CYP που αποτοξινώνουν και εξαλείφουν τις τοξικές ενδογενείς ουσίες ως αποτέλεσμα της φλεγμονής. Το LPS μείωσε σημαντικά την έκφραση των CYP. Χαμηλότερη δραστικότητα του CYP οδηγεί σε μειωμένο μεταβολισμό και έκκριση τοξικών μεταβολιτών, οδηγώντας σε συσσώρευση αυτών των μορίων και τοξικές επιδράσεις. Η χορήγηση του μελιού ελάτης και καστανιάς αύξησε την έκφραση των ενζύμων CYP στο ήπαρ των ποντικών που έλαβαν LPS, υποδηλώνοντας μια πιθανή αντιοξειδωτική επίδραση. Το βακτηριακό φορτίο αξιολογήθηκε στο αίμα, την περιτοναϊκή πλύση και τους ιστούς των ποντικών που υποβλήθηκαν σε CS. Δεν υπήρξε διαφορά στο βακτηριακό φορτίο στο αίμα και στην περιτοναϊκή πλύση μεταξύ των ομάδων που υποβλήθηκαν σε CS ενώ το βακτηριακό φορτίο ήταν χαμηλότερο στους ιστούς σπλήνα και πνεύμονα των επιμύων που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με μέλι. Σημαντικά μειωμένοι αριθμοί βακτηρίων βρέθηκαν στο ήπαρ των σηπτικών ποντικών που είχαν προηγουμένως λάβει θεραπεία μελιού καστανιάς και ελάτης σε σύγκριση με την ομάδα που υποβλήθηκε σε CS μόνο. Σημαντική μείωση του βακτηριακού φορτίου βρέθηκε επίσης στους πνεύμονες των ποντικών που υποβλήθηκαν σε CS κι έλαβαν μέλι κουμαριάς, ελάτης και μέλι Manuka. To τελικό μέρος της διατριβής αφορούσε τη χρήση μεθόδων μαζικής αλληλούχισης (sequencing) για τον εντοπισμό και την σύγκριση βακτηρίων και μυκήτων στα διάφορα δείγματα μελιού. Σκοπός αυτής της διαδικασίας ήταν να εξεταστεί η πιθανή επίδραση της μικροβιακής ποικιλότητας στην επαγωγή αντιμικροβιακής δράσης. Μέσω αυτής της προσέγγισης, επιδιώχθηκε η καλύτερη κατανόηση των μικροβιακών κοινοτήτων που συνυπάρχουν στο μέλι και η αξιολόγηση του ρόλου τους στην ενίσχυση των αντιμικροβιακών ιδιοτήτων του. Στη μελέτη μας διαπιστώθηκε ότι οι Lactobacillus επικρατούν στο μέλι ελάτης, με τον πληθυσμό των Lactobacillus να είναι υψηλότερος στο μέλι ελάτης σε σύγκριση με το μέλι ελάτης-δρυ. Συνολικά, τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το μέλι μπορεί να αποτελέσει μια πολλά υποσχόμενη συμπληρωματική θεραπεία, όχι μόνο ως αντιμικροβιακός παράγοντας αλλά και ως ενισχυτικό στη θεραπεία λοιμώξεων. Η μελέτη αυτή ανοίγει νέους δρόμους για την αξιοποίηση των φυσικών ιδιοτήτων του μελιού στην ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών, ιδιαίτερα σημαντικών σε μια εποχή όπου η μικροβιακή αντοχή αυξάνεται με ανησυχητικούς ρυθμούς.