Μελέτη της συσχέτισης της εντερικής μικροχλωρίδας και του υποκείμενου ανοσολογικού συστήματος σε ασθενείς με ΙΦΝΕ με σκοπό την ανάδειξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων

Abstract

Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis are the main Inflammatory Bowel Diseases (IBDs) and are characterized by chronic and remitting colonic inflammation leading to the disrupted architecture of the intestinal tissue, which could also result in the development of fibrosis. HT-29 epithelial cell line is widely used as an in vitro model of the immunopathological mechanisms regarding gut barrier integrity and inflammation, which are main pathophysiological characteristics observed in patients with IBD. In addition, colonic subepithelial myofibroblasts (cSEMFs) are actively involved in mucosal wound healing and inflammation and are proven to be key mediators causing fibrotic disposition during IBD. Probiotic supplements have the prospect of being used as auxiliary treatment for IBDs, with the bacterial strains Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Heyndrickxia coagulans, Lactobacillus acidophilus, Lactiplantibacillus plantarum, Lacticaseibacillus rhamnosus and the fungal strain Saccharomyces boulardii being commonly found amongst them. The main aim of the present thesis was to study the impact of the aforementioned probiotic strains, alone and in premade mixtures, in widely used cell models of IBD, in order to assess the potency of them being used as an auxiliary IBD treatment. This aim was achieved by assessing these probiotic strains’ effect on the proliferation rate and mRNA expression of pro-inflammatory CXCL8 and of tight junctions proteins in HT-29 cell line as well as their impact on the inflammatory and healing capacity of primary cSEMFs isolated from healthy individuals, from patients with Crohn’s Disease and from patients with Ulcerative Colitis.HT-29 cells were stimulated with 102 or 104 or 108 cfu/mL of the aforementioned probiotic strains alone and in various combinations for 6 hours, and their effect on the mRNA expression of the pro-inflammatory chemokine CXCL8 and on the mRNA expression of tight junctions’ proteins Claudin1, JAMA, Occludin and Zonula Occludens 1 was assessed by qRT-PCR. HT-29 were also pre-stimulated for 24 hours with IL-1α (5ng/ml) and TNF-α (50ng/ml) and then 102 or 104 or 108 cfu/mL of the mixture of Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactiplantibacillus plantarum and Saccharomyces boulardii were added for another 6 hours, in order to study the mRNA expression of these same factors. Furthermore, HT-29 cells were stimulated with 102 or 104 cfu/mL of these probiotics for 48 hours in order to assess their effect on the proliferation rate of HT-29 using Wound Healing Assay. In addition, gut biopsies from healthy individuals, from patients with Crohn’s Disease and from patients with Ulcerative Colitis were obtained and single-cell colonies of primary cSEMFs were isolated and further cultured. cSEMFs were then stimulated with 102 or 104 cfu/mL of the aforementioned probiotic strains alone and in combinations, and their effect on chemokines (CCL2, CCL5, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL14), cytokines (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-22, IL-24, IL-26, IL-32α, IL-33, IFN-γ, TNF-α) and wound healing factors (Collagen Type I, Collagen Type III, Fibronectin, Tissue Factor, α-Smooth Muscle Actin) was assessed by qRT-PCR (mRNA expression, 6-hour stimulation), ELISA (chemokine protein levels, 48-hour stimulation) and Sircol Assay (secreted collagen, 48-hour stimulation), as well as on cSEMFs migration rate, by Wound Healing Assay. The probiotic strains and mixtures studied in this thesis remained viable and altered the inflammatory and healing behavior of both HT-29 and of the cSEMFs isolated from healthy individuals and from IBD patients. In detail, the probiotic mix of B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii was added to unstimulated or IL-1α and TNF-α pre-stimulated ΗΤ-29 and it was shown that it does not alter neither the mRNA expression of the proteins of tight junctions ClDN1, JAMA, OCLN and ZO-1, nor the mRNA expression of CXCL8. Regarding the mRNA of CXCL8, its expression was promoted when HT-29 were stimulated with L. plantarum and with the higher dosage 108 cfu/mL of H. coagulans and was reduced by the lower concentrations of H. coagulans, as well as by stimulation with S. boulardii, with the mixture of B. longum and L. rhamnosus and with the mixture of B. longum, L. rhamnosus and L. acidophilus. The mRNA and protein expression of the studied chemokines and healing factors in cSEMFs isolated from healthy individuals was dependent on the strain or strains used, and their dosage. More specifically, 102 cfu/mL of B. lactis reduced the mRNA expression of CXCL1, CXCL2 and CXCL6, while 104 cfu/mL of B. lactis promoted the mRNA expression of CCL2, CCL5, CXCL1 and CXCL2. Stimulation with the strain L. acidophilus downregulated the mRNAs of CXCL2, CXCL6 and CXCL8 and upregulated the mRNA of CXCL10. L. plantarum stimulation resulted in augmenting both the mRNA and the protein expression of CXCL8 as well as the mRNA expression of CXCL10. Probiotic fungus S. boulardii increased the mRNA expression of CCL5 and CXCL5. Moving on to the expression of healing factors, the mRNAs of Collagen type Ι, Collagen type ΙΙΙ, Fibronectin and Tissue Factor were upregulated by L. plantarum stimulation and downregulated by L. acidophilus stimulation. The cSEMFs’ mRNA expression of Collagen type ΙΙΙ was also decreased by B. lactis and S. boulardii, while B. lactis also decreased the mRNA of Fibronectin. In addition, S. boulardii stimulation promoted the mRNA expression of Tissue Factor and the protein secretion of collagen of cSEMFs. Finally, stimulating healthy individuals’ cSEMFs with the mixture of B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii resulted in the non-statistically significant upregulation of the mRNA of the chemokines CXCL1, CXCL2, CXCL4, CXCL8, CXCL10, CCL2 and CCL5, in the upregulation of the mRNAs of Fibronectin and Tissue Factor as well as in the downregulation of the mRNA of α-SMA. It is worth mentioning that the mRNA expression of the cytokines ΙL-6, IL-8, IL-24 and IL-32 was non-statistically significantly increased in unstimulated cSEMFs isolated from patients with Crohn’s Disease, and adding the mixture of B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii did not further alter it, except for the slight upregulation of the mRNA of IL-24.Specifically, regarding 48-hour stimulations with the single probiotic strains, the results of the present thesis show that the bacteria B. lactis, H. coagulans and the fungus S. boulardii appear to promote the proliferation rate of HT-29 cell line. Regarding the 48-hour effect of single strains on cSEMFs isolated from healthy individuals, B. lactis, L. plantarum, S. boulardii and the lower dosage of H. coagulans promote their migratory capacity, contrary to B. longum, L. rhamnosus and the higher dosage of H. coagulans that reduce it. L. plantarum and S. boulardii stimulations also increase the migratory rate of cSEMFs isolated from patients with Crohn’s Disease but do not affect the migratory rate of cSEMFs isolated from patients with Ulcerative Colitis. It is worth mentioning that despite the aforementioned various effects observed by using different strains, the stimulations with the mixtures containing these probiotic strains appeared to exert more balanced results on HT-29 proliferation and cSEMFs healing capacities. In more detail, the mixture of B. longum and L. rhamnosus and the mixture of B. lactis and L. acidophilus promote the proliferation of HT-29, and so does the mixture of B. longum, L. acidophilus and L. rhamnosus, for the first 24 hours, although it reduces it at the end of the 48-hour incubation. The lower dosage 102 cfu/mL of the probiotic mixture of B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum and S. boulardii also reduces the proliferation of the HT-29, but this effect is apparent only for the first 24h. As far as healthy individuals cSEMFs’ migratory rate is concerned, it is promoted by the mixture of B. longum and L. rhamnosus and the higher dosage 104 cfu/mL of the probiotic mixture of B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum and S. boulardii, while it is reduced by the mixture of B. lactis and L. acidophilus and the lower dosage 102 cfu/mL of the probiotic mixture of B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum and S. boulardii. Similarly, the migration rate of cSEMFs from patients with Crohn’s Disease and of cSEMFs from patients with Ulcerative Colitis is promoted by the mixture of B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum and S. boulardii. The mixture of B. longum and L. rhamnosus was shown to reduce the migratory capacity of cSEMFs from patients with Crohn’s Disease too. In conclusion, the effects of the probiotic strains and mixtures varied significantly, with greater increase or decrease in chemokine, cytokine and healing factor expression. However, this thesis confirms that the results of the probiotics are dependent on each specific strain (or combination of strains) and the concentration that was administered. Overall, this study highlights that the use of multiple probiotic strains can potentially alert the gut mucosal immune system and promote wound healing, having a more beneficial effect on mucosal immunity than the use of single probiotics.

Η Νόσος Crohn και η Ελκώδης κολίτιδα αποτελούν τις κύριες μορφές των Ιδιοπαθών Φλεγμονωδών Νόσων του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Οι συγκεκριμένες νόσοι χαρακτηρίζονται από παρατεταμένες φλεγμονώδεις αποκρίσεις που οδηγούν στη διαταραχή της αρχιτεκτονικής του τοιχώματος του εντέρου καθώς και σε πιθανή ανάπτυξη ίνωσης. Η καρκινική επιθηλιακή κυτταροσειρά HT-29 αποτελεί ένα εγκαθιδρυμένο in vitro μοντέλο μελέτης των ανοσοπαθολογικών μηχανισμών που ενέχονται στις ΙΦΝΕ, μεταξύ αυτών η ακεραιότητα του επιθηλιακού φραγμού και οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις του εντέρου. Οι εντερικοί υποεπιθηλιακοί μυοϊνοβλάστες (ΕΥΜ) είναι κύριοι ρυθμιστές των διαδικασιών της επούλωσης και της φλεγμονής του εντερικού βλεννογονίου συστήματος. Τα βακτηριακά στελέχη Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Heyndrickxia coagulans, Lactobacillus acidophilus, Lactiplantibacillus plantarum, Lacticaseibacillus rhamnosus και ο μύκητας Saccharomyces boulardii χρησιμοποιούνται ευρέος σε προβιοτικά συμπληρώματα, με την προοπτική να χορηγηθούν και ως επικουρική θεραπεία για τις ΙΦΝΕ. Κυρίαρχο σκοπό της παρούσας διατριβής αποτελούσε η μελέτη του αντίκτυπου των προαναφερθέντων προβιοτικών στελεχών, μεμονωμένων και σε προκατασκευασμένα μείγματα, σε γνωστά κυτταρικά μοντέλα έρευνας των ΙΦΝΕ, ούτως ώστε να διερευνηθεί η δυνητικότητα χρήσης αυτών ως επικουρικών θεραπειών για τις ΙΦΝΕ. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού μελετήθηκε η επίδραση των παραπάνω προβιοτικών στην ταχύτητα πολλαπλασιασμού και στην mRNA έκφραση της φλεγμονώδους IL-8 και των στεγανών συνδέσμων στην κυτταροσειρά HT-29, καθώς και στο φλεγμονώδες και επουλωτικό δυναμικό των ΕΥΜ απομονωμένων από υγιή άτομα, από ασθενείς με Νόσο Crohn και από ασθενείς με Ελκώδη κολίτιδα.Τα HT-29 διεγέρθηκαν με 102 ή 104 ή 108 cfu/mL των προαναφερθέντων προβιοτικών, μεμονωμένων ή διαφόρων συνδυασμών αυτών, για 6 ώρες, και ο αντίκτυπος τους στην mRNA έκφραση της φλεγμονώδους χημειοκίνης CXCL8 και των πρωτεϊνών των στεγανών συνδέσεων Claudin1, JAMA, Occludin και Zonula Occludens 1 μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα HT-29 προ-διεγέρθηκαν επίσης με τις προ-φλεγμονώδεις IL-1α (5ng/ml) και TNF-α (50ng/ml) για 24 ώρες και έπειτα διεγέρθηκαν με 102 ή 104 ή 108 cfu/mL του μείγματος των Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactiplantibacillus plantarum και Saccharomyces boulardii για 6 ώρες, για τη μελέτη της έκφρασης των ίδιων παραγόντων. Ακόμα, πραγματοποιήθηκαν και 48ωρες διεγέρσεις με 102 ή 104 cfu/mL των προβιοτικών στελεχών και μειγμάτων για τη διερεύνηση της επίπτωσης τους στον πολλαπλασιαστικό ρυθμό των HT-29, με τη Δοκιμασία Επούλωσης Τραύματος. Επιπρόσθετα, λήφθηκαν ενδοσκοπικές βιοψίες παχέος εντέρου από υγιή άτομα ή από ασθενείς με Νόσο Crohn ή από ασθενείς με Ελκώδη κολίτιδα για την απομόνωση και τη μονοκαλλιέργεια πρωτογενών ανθρώπειων ΕΥΜ. Τα πρωτογενή αυτά κύτταρα διεγέρθηκαν με 102 ή 104 cfu/mL των μεμονωμένων προβιοτικών και συνδυασμών τους, με σκοπό τη μελέτη της επίδραση τους στις χημειοκινικές (CCL2, CCL5, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL14), κυτταροκινικές (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-22, IL-24, IL-26, IL-32α, IL-33, IFN-γ, TNF-α) και επουλωτικές (Κολλαγόνο Τύπου I, Κολλαγόνο Τύπου III, Φιμπρονεκτίνη, Tissue Factor, α-Smooth Muscle Actin) εκκρίσεις χρησιμοποιώντας qRT-PCR (έκφραση mRNA, 6ωρη επώαση), ELISA (πρωτεϊνικά επίπεδα χημειοκινών, 48ωρη επώαση) και Sircol Assay (εκκρινόμενο κολλαγόνο, 48ωρη επώαση). Τέλος, έγινε διέγερση των ΕΥΜ υγιών ατόμων και ασθενών με τα προβιοτικά για 48 ώρες, με στόχο τη διαλεύκανση της επιρροής τους στην ταχύτητα μετανάστευσης των ΕΥΜ, μέσω της Δοκιμασίας Επούλωσης Τραύματος. Οι υπό μελέτη προβιοτικοί οργανισμοί παραμένουν ζωντανοί και μεταβάλουν τη φλεγμονώδη και την επουλωτική συμπεριφορά των HT-29, των ΕΥΜ των υγιών ατόμων και των ΕΥΜ ασθενών με ΙΦΝΕ. Συγκεκριμένα, η προσθήκη του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii στα αδιέγερτα ΗΤ-29 ή στα προ-διεγερμένα με IL-1α και TNF-α ΗΤ-29 δεν επηρέασε την mRNA έκφραση των πρωτεϊνών των στεγανών συνδέσμων ClDN1, JAMA, OCLN και ZO-1, αλλά ούτε και της CXCL8. Όσον αφορά στην mRNA έκφραση της CXCL8, αυξήθηκε από την προσθήκη του μεμονωμένου L. plantarum και από την προσθήκη της μεγαλύτερης συγκέντρωσης 108 cfu/mL του H. coagulans, ενώ μειώθηκε από την προσθήκη των μικρότερων συγκεντρώσεων του H. coagulans, καθώς και από την προσθήκη του S. boulardii, του μείγματος των B. longum και L. rhamnosus και του μείγματος των B. longum, L. rhamnosus και L. acidophilus. Η mRNA και πρωτεϊνική έκφραση των υπό μελέτη χημειοκινών και επουλωτικών παραγόντων από τους ΕΥΜ υγιών ατόμων ήταν άμεσα εξαρτώμενη από το στέλεχος ή τα στελέχη που χορηγήθηκαν, αλλά και από τη δόση που χρησιμοποιήθηκε. Η μικρότερη δόση B. lactis φάνηκε πως καταστέλλει την mRNA έκφραση των CXCL1, CXCL2 και CXCL6, ενώ η μεγαλύτερη δόση ωθεί την έκφραση των CCL2, CCL5, CXCL1 και CXCL2. H χορήγηση του L. acidophilus μείωσε την mRNA έκφραση της CXCL2, της CXCL6 και της CXCL8, ενώ αύξησε το mRNA της CXCL10. Το μεμονωμένο L. plantarum αύξησε την mRNA και την πρωτεϊνική έκφραση της CXCL8 και την mRNA έκφραση της CXCL10. Ο προβιοτικός μύκητας S. boulardii δείχθηκε πως αυξάνει τα mRNA της CCL5 και της CXCL5. Η έκφραση των mRNA του Κολλαγόνου τύπου Ι, του Κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ, της Φιμπρονεκτίνης και του Tissue Factor αυξήθηκε από την προσθήκη του L. plantarum και μειώθηκε από την προσθήκη του L. acidophilus. Η mRNA έκφραση του Κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ μειώθηκε επίσης από τα μεμονωμένα B. lactis και S. boulardii, ενώ το B. lactis μείωσε και την mRNA έκφραση της Φιμπρονεκτίνης. Επιπλέον, το mRNA του Tissue Factor και η πρωτεϊνική έκκριση κολλαγόνου αυξήθηκαν από την χορήγηση του S. boulardii. Τέλος, η διέγερση των ΕΥΜ υγιών ατόμων με το μείγμα των προβιοτικών B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii οδήγησε στη μικρή αλλά στατιστικώς σημαντική αύξηση της mRNA έκφρασης των χημειοκινών CXCL1, CXCL2, CXCL4, CXCL8, CXCL10, CCL2 και CCL5, στην αύξηση της mRNA έκφρασης της Φιμπρονεκτίνης και του Tissue Factor, ενώ παράλληλα μείωσε την mRNA έκφραση της α-SMA. Αξίζει να αναφερθεί ακόμα ότι η mRNΑ έκφραση των ιντερλευκινών ΙL-6, IL-8, IL-24 και IL-32 ήταν μη στατιστικώς σημαντικά αυξημένη στους αδιέγερτους ΕΥΜ από τους ασθενείς με Νόσο Crohn, και η προσθήκη του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii δεν την επηρέασε περεταίρω, με εξαίρεση μια μικρή αλλά επίσης μη στατιστικώς σημαντική αύξηση στο mRNA της IL-24.Όσον αφορά στα αποτελέσματα της χρήσης των μεμονωμένων στελεχών στον πολλαπλασιαστικό ρυθμό των HT-29 έπειτα από 48 ώρες διέγερσης, η χορήγηση των μεμονωμένων B. lactis, H. coagulans και S. boulardii φαίνεται πως τον ωθεί. Όσον αφορά στα αποτελέσματα της χορήγησης των μεμονωμένων προβιοτικών στελεχών στους ΕΥΜ υγιών ατόμων, το B. lactis, το L. plantarum, το S. boulardii και η μικρότερη δόση του H. coagulans αυξάνουν τη μεταναστευτική τους ικανότητα, ενώ το B. longum, το L. rhamnosus και η μεγαλύτερη δόση του H. coagulans τη μειώνουν. Προωθημένη είναι και η μετανάστευση των ΕΥΜ των ασθενών με Νόσο Crohn αλλά όχι των ασθενών με Ελκώδη κολίτιδα έπειτα από την προσθήκη του L. plantarum και του S. boulardii.Αν και η χρήση του κάθε μεμονωμένου στελέχους είχε διαφορετικές απόρροιες και στα δύο πειραματικά συστήματα, η παράλληλη χρήση πολλαπλών στελεχών ως προβιοτικών μειγμάτων έδειξε ικανή να εξισορροπήσει τα αποτελέσματα στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό τόσο των HT-29 όσο και των ΕΥΜ. Πιο λεπτομερώς, οι διεγέρσεις των HT-29 κυττάρων με το μείγμα των B. longum και L. rhamnosus και με το μείγμα των B. lactis και L. acidophilus επίσης αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό τους. Παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρείται και στο πρώτο 24ωρο διέγερσης των HT-29 με το μείγμα των B. longum, L. acidophilus και L. rhamnosus, αν και στο τέλος του δευτέρου 24ωρου το μείγμα αυτό κατέστειλε τελικά τον πολλαπλασιασμό. Η προσθήκη της μικρότερης δόσης 102 cfu/mL του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum και S. boulardii δείχθηκε ικανή να ελαττώσει το ρυθμό πολλαπλασιασμού HT-29, επίσης μόνο για τις πρώτες 24 ώρες. Αναφορικά με το μεταναστευτικό ρυθμό των ΕΥΜ υγιών ατόμων, φάνηκε πως ωθείται τόσο από το μείγμα των B. longum και L. rhamnosus όσο και την υψηλότερη δόση του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum και S. boulardii. Αντίθετα, το μεταναστευτικό δυναμικό των ΕΥΜ υγιών ατόμων μειώνεται από τη χορήγηση του μείγματος των B. lactis and L. acidophilus, και τη μικρότερη δόση του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum and S. boulardii. Ο μεταναστευτικός ρυθμός τόσο των ΕΥΜ από άτομα με Ελκώδη κολίτιδα όσο και των ΕΥΜ ασθενών με Νόσο Crohn εμφανίστηκε δοσοεξαρτώμενα αυξημένος έπειτα από την προσθήκη του μείγματος των προβιοτικών B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii. Επίσης, το μείγμα των Bifidobacterium longum και Lacticaseibacillus rhamnosus φάνηκε πως μειώνει το μεταναστευτικό δυναμικό των ΕΥΜ ασθενών με Νόσο Crohn.Συμπερασματικά, ο αντίκτυπος των διαφόρων προβιοτικών στελεχών φαίνεται πως ποικίλλει, με μεγαλύτερη ή μικρότερη σημαντικότητα στους χημειοκινικούς, κυτταροκινικούς και επουλωτικούς παράγοντες που εξετάστηκαν. Ωστόσο, η παρούσα διατριβή επαληθεύει πως η απόρροια των προβιοτικών είναι άμεσα εξαρτώμενη από το εκάστοτε στέλεχος που χρησιμοποιείται (ή το συνδυασμό στελεχών) και τη χορηγηθείσα συγκέντρωση. Εν κατακλείδι, η τρέχουσα εργασία αναδεικνύει πως η ταυτόχρονη χορήγηση διαφορετικών μικροοργανισμών μπορεί να ενεργοποιήσει το εντερικό ανοσοποιητικό βλεννογόνιο σύστημα και να προωθήσει τις διαδικασίες επούλωσης, προσφέροντας βελτιστοποιημένα αποτελέσματα συγκριτικά με τη χρήση των αντίστοιχων μεμονωμένων στελεχών.