Ανάπτυξη μεσοσπονδύλιου δίσκου από μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα λιπώδους ιστού ανθρώπου σε τρισδιάστατα εκτυπωμένα ικριώματα

Abstract

Degenerative Disc Disease constitutes a disorder with growing incidence in current years, being unfavorably associated with chronic pain, disability and functional impairment in affected individuals. In this context, available therapeutic options, both conservative and surgical, present significant limitations, featuring no capability of disease course reversion. The development of an integral intervertebral disc implant using methods of Tissue-Engineering (Tissue-Engineered Intervertebral Disc, TE-IVD) represents a theoretically attractive option to overcome these limitations, being already accomplished in vitro according to recent data. However, none of these studies reported the construction of a TE-IVD from human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells (human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells, hADMSCs), which are known for their superior biological and functional properties compared to other cell types, being thus routinely recruited in various Tissue-Engineering applications in recent years. Hence, aim of this laboratory investigation is the assessment of hADMSCs potential in development of TE-IVD composed of a composite biphasic scaffold, targeting in more accurate representation of physiological IVD properties. For this purpose, hADMSCs derived from subcutaneous abdominal fat were harvested, isolated in vitro and characterized based on standardized methodology under good manufacturing practice (cGMP) conditions. The composition of the annulus fibrosus was carried out using 3D-printed polycaprolactone (PCL) scaffolds with computational software, while the composition of the nucleus pulposus was made with a tissue fibrin glue scaffold at appropriate dilution, aiming to improve cellular viability. Design of scaffolds was conducted based on established parameters derived from previous morphometric, biomechanical and histologic assessment of physiologic ovine cervical intervertebral discs. hADMSCs were initially introduced into the fibrin glue scaffold, followed by the injection into the PCL scaffolds resulting in the fabrication of integral implants which were subjected to in vitro culture for a period of 21 days. TE-IVD evaluation was carried out by biomechanical assessment (cyclic compression, creep, and compression till failure testing procedures), histological evaluation with confocal microscopy and microstructural analysis with a micro-CT scanner. Results showed that fabricated TE-IVD implants demonstrated notable similarity in their characteristics to those of the physiologic intervertebral disc in terms of biomechanical behavior in all performed investigations. Histological evaluation revealed satisfactory cell viability within the scaffolds, a characteristic that was also confirmed by microstructural analysis. In conclusion, the in vitro fabrication of a unified TE-IVD implant from the implantation of hADMSCs into appropriate scaffolds represents a feasible process in a laboratory setting, highlighting, in addition to other advantages, the chondrogenic potential of these cells. These findings warrant, however, further investigation from future studies.

Η Εκφυλιστική Νόσος του Μεσοσπονδυλίου Δίσκου αποτελεί μία πάθηση με διαρκώς αυξανόμενη επίπτωση στα σύγχρονα έτη, συσχετιζόμενη δυσμενώς με χρόνιο άλγος, αναπηρία και περιορισμό της λειτουργικότητας των ασθενών. Στο πλαίσιο αυτό, οι υπάρχουσες θεραπευτικές επιλογές, συντηρητικές αλλά και χειρουργικές, παρουσιάζουν αξιοσημείωτους περιορισμούς, χωρίς δυναμικό αναστροφής της πορείας της νόσου. Η ανάπτυξη ενός ενιαίου εμφυτεύματος μεσοσπονδυλίου δίσκου με τις μεθόδους της Ιστομηχανικής (Ιστοτεχνολογικά Ανεπτυγμένος Μεσοσπονδύλιος Δίσκος, ΙΑΜΔ) αποτελεί μία θεωρητικά ελκυστική επιλογή για την υπέρβαση των περιορισμών αυτών, έχοντας καταστεί εφικτή σε in vitro επίπεδο σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα. Ωστόσο, σε καμία από τις μελέτες αυτές δεν επιχειρήθηκε η κατασκευή ενός εμφυτεύματος από Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα προερχόμενα από λιπώδη ιστό ανθρώπου (human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells, hADMSCs), τα οποία είναι γνωστά για τις ανώτερες βιολογικά και λειτουργικά ιδιότητες έναντι των έτερων κυτταρικών τύπων, με την χρήση τους να καθίσταται ελκυστική σε διάφορες εφαρμογές του πεδίου της Ιστομηχανικής τα τελευταία έτη. Έτσι, σκοπός της παρούσας εργαστηριακής μελέτης είναι η αξιολόγηση του δυναμικού των hADMSCs στην ανάπτυξη ΙΑΜΔ χρησιμοποιώντας ένα σύνθετο διφασικό ικρίωμα, με στόχο την αρτιότερη αντιπροσώπευση των ιδιοτήτων του φυσιολογικού δίσκου. Για τον σκοπό αυτόν, hADMSCs προερχόμενα από υποδόριο λίπος κοιλιακής χώρας λήφθηκαν, απομονώθηκαν in vitro και χαρακτηρίστηκαν με βάση προτυποποιημένη μεθοδολογία σε συνθήκες καλής κατασκευαστικής πρακτικής (cGMP). H σύνθεση του ινώδους δακτυλίου πραγματοποιήθηκε με την τρισδιάστατη εκτύπωση ικριωμάτων πολυκαπρολακτόνης (polycaprolactone, PCL) με υπολογιστικό λογισμικό, ενώ η σύνθεση του πηκτοειδούς πυρήνα με ιστική κόλλα ινικής σε κατάλληλη αραίωση, προς βελτίωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. O σχεδιασμός των ικριωμάτων πραγματοποιήθηκε με βάση παραμέτρους αναφοράς από προηγούμενη μορφομετρική, εμβιομηχανική, και ιστολογική μελέτη φυσιολογικών προβείων αυχενικών μεσοσπονδυλίων δίσκων. Διενεργήθηκε εισαγωγή των hADMSCs εντός της κόλλας ινικής με έγχυση εν συνεχεία των συμπλόκων στα ικριώματα PCL, με απότοκο την δημιουργία ενιαίων εμφυτευμάτων με καλλιέργεια in vitro για χρονικό διάστημα 21 ημερών. Η αξιολόγηση των εμφυτευμάτων διενεργήθηκε με μελέτη της εμβιομηχανικής συμπεριφοράς τους (δοκιμασίες κυκλικής συμπίεσης, ερπυσμού και ελέγχου ορίου θραύσης με καμπύλες τάσης-παραμόρφωσης), με ιστολογική αξιολόγηση με συνεστιακή μικροσκοπία και με ανάλυση μικροδομής με μικροτομογράφο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κατασκευασμένα εμφυτεύματα ΙΑΜΔ παρουσίασαν αξιόλογη εγγύτητα των χαρακτηριστικών τους με αυτά του φυσιολογικού μεσοσπονδύλιου δίσκου σε επίπεδο εμβιομηχανικής συμπεριφοράς και στις τρεις δοκιμασίες. Η ιστολογική αξιολόγηση ανέδειξε ικανοποιητική βιωσιμότητα των κυττάρων εντός των ικριωμάτων, χαρακτηριστικό το οποίο επιβεβαιώθηκε επίσης και από την ανάλυση μικροδομής. Συμπερασματικά, η in vitro κατασκευή ενιαίου εμφυτεύματος ΙΑΜΔ από την εμφύτευση hADMSCs σε κατάλληλα ικριώματα αποτελεί μία εφικτή διαδικασία σε εργαστηριακό περιβάλλον, υπογραμμίζοντας, πέραν των έτερων πλεονεκτημάτων, το δυναμικό χονδρογένεσης των κυττάρων αυτών. Τα ευρήματα αυτά χρήζουν περαιτέρω έρευνας από μελλοντικές μελέτες.