Μελέτη των επιπτώσεων επαγωγής των πρωτεοστατικών μηχανισμών στη γήρανση και σε ηλικιοεξαρτώμενες ασθένειες

Abstract

Organisms are exposed to various stress conditions throughout their lifespan. To maintain their proteome integrity, the cells have developed a highly conserved network, namely the Proteostasis Network (PN). The PN mechanisms are responsible for the protein quality control, under normal and stress conditions, from synthesis to folding and degradation. The latter is mediated mainly through the ubiquitin-proteasome system (UPS) and the autophagy lysosomal pathway (ALP). Deregulation of the PN is considered as one of the hallmarks of aging. Impaired proteostasis balance upon aging leads to the accumulation of misfolded proteins and aggregates, contributing to the onset and progression of proteinopathies. Recent studies suggest that the PN regulation is subjected to both cell-autonomous and cell non-autonomous levels. Given that tissues are not affected equally by endogenous and external stress factors, tissue communication under adverse conditions through cell non-autonomous signaling pathways is crucial for the quality of the proteome. The elucidation of the mechanisms underlying the cell non-autonomous regulation of the PN, may provide new approaches to the regulation of proteostasis, including the potential for improvement of proteostasis by targeting only a small number of cells to alleviate the effects of aging and age-related diseases. The proteasome is considered as a potent antiaging target since various studies support that its increased activity results in enhanced lifespan in cells and multicellular organisms such as the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) and the fly Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Moreover, the role of the proteasome appears to be important in age-related pathological conditions such as proteinopathies, including Alzheimer's disease (AD), by preventing the formation of protein aggregates, a phenomenon that characterizes these disorders. However, the mechanisms through which the proteasome activation affects lifespan and aggregation-related pathologies have not been fully elucidated. More importantly, despite the highly important role of the proteasome in the PN, its potential cell non-autonomous regulation has never been studied. The main proteasome complex is the "20S core", composed of four rings of seven different α (α1-7, outer rings) and seven different β (β1-7, inner rings) subunits. The two inner rings exert proteolysis through β1 (caspase-like/ C-L), β2 (trypsin-like/ T-L) and β5 (chymotrypsin-like/ CT-L) subunits. We have previously revealed that overexpression of the β5 proteasome subunit in all tissues of C. elegans is sufficient to enhance the proteasome activity which in turn leads to lifespan extension and confers resistance to oxidative and proteotoxic stress. To investigate the potent cell non-autonomous regulation of the proteasome, we generated transgenic C. elegans strains that overexpress the pbs-5 (β5 ortholog in the nematode) gene in a tissue specific manner in the neurons (pbs-5-neurons), the intestine (pbs-5-inestine) and the muscles (pbs-5-muscles), and we studied the effect of this expression on proteasome activity in distal tissues. Furthermore, we investigated the effects of tissue-specific pbs-5 overexpression on lifespan and resistance to oxidative and proteotoxic stress. Our results reveal that the activation of the proteasome in a single tissue can affect proteostasis in distal tissues in the nematode. More specifically, tissue-specific pbs-5 overexpression in the neurons or in the intestine can enhance the proteasome activity in the muscles, revealing for the first time the cell non-autonomous proteasome regulation. Furthermore, we show that this cell non-autonomous regulation is sufficient to prevent the proteotoxic effects of the amyloid-β (Aβ) peptide (a peptide strongly correlated with AD) in the muscles of nematode models for AD. We also observed that muscle-specific pbs-5 overexpression can cell-autonomously enhance the proteasome activity and resistance to the Aβ-mediated proteotoxicity in the same tissue (muscles). Likewise, cell-autonomous resistance to Aβ proteotoxicity is also observed in strains that overexpress the pbs-5 gene and the Αβ peptide in neurons. In respect to the effects of tissue-specific pbs-5 overexpression on lifespan, we observed that the overexpression of the pbs-5 gene only in the intestine or in the muscles of C. elegans is not sufficient to enhance the lifespan of the nematode. In contrast, pbs-5 overexpression in the neurons of C. elegans, maintains the levels of phenotypic characteristics related to the healthspan of the animal and leads to lifespan extension. Nevertheless, the enhancement of life expectancy does not seem to be related to enhanced antioxidant protection, since no resistance to oxidative stress was observed. Finally, we further investigated the mechanisms underlying the cell non-autonomous regulation of the proteasome between neurons and muscles. We provide evidence that this interconnection occurs via a specific type of synaptic vesicles, the small clear vesicles (SCVs) and we identified glutamate as at least one of the responsible neurotransmitters. Our results confirm the hypothesis of cell non-autonomous regulation of the proteasome. The effects of tissue-specific proteasome overexpression in distal tissues, may provide important knowledge for the design of interventions that target tissue-specific manipulation of proteasome activity.

Οι οργανισμοί κατά τη διάρκεια της ζωής τους εκτίθενται σε διάφορες στρεσογόνες συνθήκες. Τα κύτταρα προκειμένου να διατηρήσουν την ακεραιότητα του πρωτεώματός τους (του συνόλου των πρωτεϊνών), τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες στρες, έχουν αναπτύξει ένα εξαιρετικά διατηρημένο και σύνθετο δίκτυο, γνωστό ως το δικτύο της πρωτεόστασης (ΔΠ). Οι μηχανισμοί του ΔΠ ελέγχουν την ποιότητα των πρωτεϊνών κατά τη σύνθεση, αναδίπλωση και αποικοδόμησή τους. Η τελευταία επιτυγχάνεται κυρίως μέσω του συστήματος ουμπικιτίνης-πρωτεασώματος (ubiquitin-proteasome system, UPS) ή μέσω του μηχανισμού αυτοφαγίας-λυσοσώματος (autophagy-lysosome pathway, ALP). Δεδομένου ότι οι ιστοί δεν επηρεάζονται εξίσου από τους περιβαλλοντικούς και τους ενδογενείς στρεσογόνους παράγοντες, η ιστική επικοινωνία του ΔΠ υπό αντίξοες συνθήκες μέσω μη αυτόνομων κυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης (δηλαδή μονοπατιών που δρουν σε κύτταρα απομακρυσμένων ιστών και όχι στα κύτταρα του ιστού που αρχικά παράγει το σήμα), είναι κρίσιμη για την ακεραιότητα του πρωτεώματος σε επίπεδο οργανισμού. Τα τελευταία χρόνια, ένας ολοένα αυξανόμενος αριθμός μελετών διερευνά τη ρύθμιση των πρωτεοστατικών μηχανισμών σε μη αυτόνομο κυτταρικό επίπεδο. Λαμβάνοντας υπόψη πως η λειτουργία του ΔΠ φθίνει με την εξέλιξη της γήρανσης, η διαλεύκανση των μηχανισμών της μη αυτόνομης κυτταρικής ρύθμισης του ΔΠ μπορεί να προσφέρει νέες προσεγγίσεις στη ρύθμιση των πρωτεοστατικών μηχανισμών, με στόχο την καθυστέρηση των επιπτώσεων της γήρανσης και των ηλικιοεξαρτώμενων παθήσεων. Το πρωτεάσωμα αποτελεί έναν σημαντικό αντιγηραντικό στόχο, καθώς αρκετές μελέτες υποστηρίζουν πως αύξηση της ενεργότητάς του έχει ως αποτέλεσμα την επιμήκυνση του προσδόκιμου ζωής (lifespan) τόσο σε κυτταρικές σειρές όσο και σε πολυκύτταρους οργανισμούς όπως ο νηματώδης σκώληκας Caenorhabditis elegans (C. elegans) και η μύγα Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Επιπλέον, σημαντικός δείχνει να είναι ο ρόλος του πρωτεασώματος και σε ηλικιοεξαρτώμενες παθολογικές καταστάσεις, όπως η νόσος του Alzheimer (AD), μέσω της παρεμπόδισης της δημιουργίας πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων που χαρακτηρίζουν τις συγκεκριμένες ασθένειες. Ωστόσο, οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η αύξηση της ενεργότητάς του επιδρά θετικά στο προσδόκιμο ζωής δεν έχουν διαλευκανθεί πλήρως. Επιπλέον, παρά τον εξαιρετικά σημαντικό ρόλο του πρωτεασώματος στο ΔΠ, ελάχιστες μελέτες μέχρι στιγμής αναφέρονται στην πιθανή μη αυτόνομη κυτταρική ρύθμισή του. Το βασικό σύμπλοκο του πρωτεασώματος ονομάζεται «20S πυρήνας» και αποτελείται από τέσσερις δακτυλίους επτά διαφορετικών α (εξωτερικοί δακτύλιοι) και β (εσωτερικοί δακτύλιοι) υπομονάδων. Οι υπομονάδες β1, β2 και β5 αποτελούν τα καταλυτικά κέντρα του συμπλόκου. Σύμφωνα με προηγούμενη έρευνα του εργαστηρίου μας, η υπερέκφραση της β5 υπομονάδας του πρωτεασώματος σε όλους τους ιστούς του C. elegans (γονίδιο pbs-5) έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του πρωτεασώματος και οδηγεί σε επιμήκυνση του προσδόκιμου ζωής και σε ανθεκτικότητα έναντι οξειδωτικού και πρωτεοτοξικού στρες. Προκειμένου να διερευνήσουμε την ενδεχόμενη μη αυτόνομη κυτταρική ρύθμιση του πρωτεασώματος, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά στελέχη C. elegans τα οποία υπερεκφράζουν ιστοειδικά το γονίδιο pbs-5 στον νευρικό ιστό (pbs-5-νευρώνες), στο έντερο (pbs-5-έντερο) και στους μυς (pbs-5-μυς) του ζώου και μελετήσαμε αρχικά την επίδραση αυτής της έκφρασης στην ενεργότητα του πρωτεασώματος σε άλλους ιστούς. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η επίδραση της ρύθμισης αυτής στο προσδόκιμο ζωής και στην απόκριση και ανθεκτικότητα σε οξειδωτικό και πρωτεοτοξικό στρες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν πως η υπερέκφραση του γονιδίου pbs-5 ιστοειδικά στους νευρώνες ή στο έντερο του C. elegans οδηγεί σε ενίσχυση της πρωτεασωμικής ενεργότητας στους μυς του ζώου, υποδηλώνοντας την παρουσία μη αυτόνομου κυτταρικού μηχανισμού ρύθμισης του πρωτεασώματος. Επιπλέον, στα συγκεκριμένα στελέχη, pbs-5-νευρώνες και pbs-5-έντερο, παρατηρείται μη αυτόνομη κυτταρική προστατευτική δράση έναντι της πρωτεοτοξικότητας του ανθρώπινου Αβ πεπτιδίου (η συσσώρευση του οποίου αποτελεί χαρακτηριστικό της AD) που εκφράζεται στους μυς του σκώληκα. Η ενίσχυση της πρωτεασωμικής ενεργότητας στους μυς και η προστασία έναντι της πρωτεοτοξικότητας του Αβ πεπτιδίου παρατηρούνται και σε αυτόνομο επίπεδο όπως αποκαλύφθηκε μέσω της υπερέκφρασης του γονιδίου pbs-5 στον ίδιο ιστό (μυς). Ανάλογη αυτόνομη κυτταρική δράση έναντι του πρωτεοτοξικού στρες παρατηρήθηκε και στα στελέχη που υπερεκφράζουν το γονίδιο pbs-5 και το ανθρώπινο Αβ πεπτίδιο στους νευρώνες. Όσον αφορά στο προσδόκιμο ζωής, αποκαλύψαμε πως η υπερέκφραση του γονιδίου pbs-5 μόνο στο έντερο ή μόνο στους μυς δεν αρκεί για να ενισχύσει τη μακροβιότητα του ζώου. Αντίθετα, η υπερέκφραση του pbs-5 γονιδίου στο νευρικό ιστό του C. elegans φαίνεται να διατηρεί σε καλύτερα επίπεδα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την ευζωία του ζώου (healthspan) και οδηγεί σε επιμήκυνση του προσδόκιμου ζωής του. Ωστόσο, η ενίσχυση του προσδόκιμου ζωής δεν φαίνεται να σχετίζεται με την ενίσχυση της αντιοξειδωτικής προστασίας, καθώς δεν παρατηρήθηκε προστασία έναντι του οξειδωτικού στρες. Τέλος, λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω αποτελέσματα στοχεύσαμε στη διαλεύκανση του τρόπου επικοινωνίας μεταξύ του νευρικού και του μυϊκού ιστού όσον αφορά στη ρύθμιση του πρωτεασώματος. Αποκαλύψαμε πως κομβικό ρόλο σε αυτή την επικοινωνία έχουν τα μικρά διαυγή κυστίδια (small clear vesicles - SCVs), τα οποία εντοπίζονται στον προσυναπτικό νευρώνα και το περιεχόμενό τους αποτελείται από νευροδιαβιβαστές. Παράλληλα, ταυτοποιήσαμε το γλουταμινικό οξύ ως έναν από τους νευροδιαβιβαστές που συμβάλλουν σε αυτήν τη ρύθμιση. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν την υπόθεση της μη αυτόνομης κυτταρικής ρύθμισης της λειτουργίας του πρωτεασώματος. Η επίδραση της ιστοειδικής έκφρασης του πρωτεασώματος σε απομακρυσμένους ιστούς μπορεί να αποτελέσει σημαντική γνώση για τον σχεδιασμό παρεμβάσεων που στοχεύουν στην ιστοειδική ενίσχυση ή αναστολή της δράσης του πρωτεασώματος.