Mechanistic insights into lignocellulose-degrading enzymes using structural biology and protein engineering methods

Abstract

Enzymatic degradation of lignocellulosic biomass has gained increasing interest in recent years, complementing existing chemical and mechanical pretreatment processes. Investigating the mechanism of enzyme activity and designing improved biocatalysts through protein engineering methods can enhance their effective application in industrial processes. In this doctoral dissertation, four enzymes derived from the thermophilic fungus Thermothelomyces thermophilus were examined. These enzymes contribute to the degradation of the three main components of lignocellulose: cellulose, hemicellulose, and lignin. The study of these specific biocatalysts was conducted by correlating their structure and function properties. Structural studies primarily utilized X-ray crystallography, along with molecular biology techniques and computational tools for simulating enzyme-substrate interactions. Specifically, a lytic polysaccharide monooxygenase (TtLPMO9F), which oxidatively cleaves glycosidic bonds in cellulose, was analyzed. By determining its crystallographic structure and conducting biochemical studies on various point variants, the contribution of specific amino acids to catalytic activity was identified. Additionally, the synergistic action of TtLPMO9F with commercial lignocellulose-degrading enzyme formulations was evaluated. Furthermore, the structure of a laccase (TtLMCO1) with notable biotechnological interest was presented, as it can oxidize various phenolic compounds. Docking simulations of the enzyme's interaction with different substrates revealed that the architecture of its substrate-binding region correlates with its preference for ortho-substituted phenolic compounds. The second part of the dissertation focuses on two hydrolytic enzymes associated with hemicellulose degradation. Specifically, the crystallographic structures of complexes of a xylanase from the GH30_7 subfamily (TtXyn30A) and its inactive mutants with various xylo-oligosaccharide substrates were determined. This enabled the identification of amino acids responsible for the enzyme's dual mode of action. Finally, the first crystal structure of an acetate esterase from the CE16 family (TtCE16B) was resolved. The crystallographic structure of TtCE16B and an inactive mutant (S19A) in complex with an acetate molecule identified the catalytic amino acids forming the active site and the structural features determining the enzyme's preference for soluble xylo-oligosaccharides. The findings of this study contribute to a deeper understanding of the mechanisms of these specific biocatalysts for the utilization of plant biomass. At the same time, by modifying the enzyme’s architecture using protein engineering methods, new pathways can be opened for their optimal use in industrial processes and new biocatalytic applications.

Η ενζυμική αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας αποκτά ολοένα και μεγαλύτερη δυναμική τα τελευταία χρόνια, συμπληρωματικά στις υπάρχουσες διεργασίες χημικής και μηχανικής προκατεργασίας. Η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης των ενζύμων αλλά και ο σχεδιασμός βελτιωμένων βιοκαταλυτών μέσα από μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής, μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη εφαρμογή τους σε βιομηχανικές διεργασίες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάστηκαν τέσσερα ένζυμα τα οποία προέρχονται από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophilus και συμβάλλουν στην αποικοδόμηση των τριών βασικών συστατικών της λιγνοκυτταρίνης: της κυτταρίνης, της ημικυτταρίνης και της λιγνίνης. Η μελέτη των συγκεκριμένων βιοκαταλυτών πραγματοποιήθηκε μέσω της συσχέτισης των δομής-λειτουργίας. Για τη δομική μελέτη χρησιμοποιήθηκε κυρίως Κρυσταλλογραφία Ακτίνων Χ, αλλά και τεχνικές Μοριακής Βιολογίας καθώς και υπολογιστικά εργαλεία προσομοίωσης των αλληλεπιδράσεων των ενζύμων με τα υποστρώματα τους. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε μία μια λυτική μονοοξυγενάση πολυσακχαριτών (ΤtLPMO9F), η οποία διασπά οξειδωτικά τους γλυκοζιδικούς δεσμούς της κυτταρίνης. Με τον προσδιορισμό της κρυσταλλογραφικής της δομής και την βιοχημική μελέτη διαφόρων σημειακών μεταλλαγμάτων, εντοπίστηκε η συνεισφορά συγκεκριμένων αμινοξέων στην καταλυτική δράση. Αξιολογήθηκε επίσης η συνεργιστική δράση της TtLPMO9F με εμπορικά σκευάσματα ενζύμων που αποικοδομούν την λιγνοκυτταρίνη. Επιπρόσθετα παρουσιάζεται η δομή μιας λακκάσης (TtLMCO1) η οποία παρουσιάζει ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον καθώς μπορεί να οξειδώνει διάφορες φαινολικές ενώσεις. Προσομοιώσεις της αλληλεπίδρασης του ενζύμου με διάφορα υποστρώματα (docking simulations), έδειξαν ότι η αρχιτεκτονική της περιοχής πρόσδεσης υποστρωμάτων σχετίζεται με την προτίμηση του ενζύμου για ορθο-υποκατεστημένες φαινολικές ενώσεις. Το 2ο σκέλος της διατριβής εστιάζει σε 2 υδρολυτικά ένζυμα που σχετίζονται με την αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης. Πιο συγκεκριμένα, ο προσδιορισμός κρυσταλλογραφικών δομών συμπλόκων μίας ξυλανάσης της υπο-οικογένειας GH30_7 (ΤtXyn30A) και ανενεργών μεταλλαγμάτων αυτής, με διάφορα υποστρώματα ολιγομερών ξυλάνης, επέτρεψε τον εντοπισμό των αμινοξέων που καθορίζουν το διπλό μηχανισμό δράσης του ενζύμου. Τέλος, στο πλαίσιο της διατριβής προσδιορίστηκε η πρώτη κρυσταλλική δομή εστεράσης οξικού οξέος της οικογένειας CE16 (ΤtCE16B). Η κρυσταλλογραφική δομή της ΤtCE16B καθώς και αυτή ενός ανενεργού μεταλλάγματος της (S19A) σε σύμπλοκο με ένα μόριο οξικού οξέος, οδήγησε στον εντοπισμό των καταλυτικών αμινοξέων που διαμορφώνουν το ενεργό κέντρο, καθώς και των δομικών χαρακτηριστικών που καθορίζουν την προτίμηση του ενζύμου για διαλυτούς ξύλο-ολιγοσακχαρίτες. Τα συμπεράσματα της παρούσας μελέτης συμβάλλουν στην βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης των συγκεκριμένων βιοκαταλυτών για την αξιοποίηση της φυτικής βιομάζας. Ταυτόχρονα, μέσα από την τροποποίηση της αρχιτεκτονικής των ενζύμων με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής ανοίγονται δρόμοι για την βέλτιστη χρήση τους σε βιομηχανικές διεργασίες αλλά και νέες βιοκαταλυτικές εφαρμογές.