The impact of indigenous vine yeasts on wine quality and character

Abstract

While biogeography originally focused on plants and animals, recent studies expand the biogeography theory to include the microbial world, meaning that diverse environments may accommodate distinctive microbial assemblages. In the case of wine, accumulating data show that geographically distant viticultural regions may possess genetically distinct microbial communities. An important aspect for the wine industry is whether such local communities or populations may result into different wine phenotypes, thus supporting the so-called microbial terroir concept. To the best of our knowledge, there are currently only a limited number of studies exploring whether the geographic origin of S. cerevisiae strains correlates with the characteristics of the wines resulting from their fermentation. In this perspective, the main objective of this study was to characterize phenotypically the different S. cerevisae strains of major viticultural regions in Greece and to estimate the phenotypic differences of regional S. cerevisiae strains. For this purpose, 226 genetically different S. cerevisiae strains isolated from four main viticultural zones of Greece, i.e., Santorini, Peza (Crete), and two viticulture zones in Peloponnese (Nemea and Mantineia), were phenotypically characterized. The extensive dataset of the present research, which includes kinetics and metabolic characteristics determined during fermentation, provides a comprehensive atlas of the wine yeast phenotypic diversity. Since the volatile compounds contribute to the richness of wine aroma, studying these compounds quantitatively and qualitatively has attracted considerable interest from the scientific community. The accuracy and sensitivity in sample preparation are crucial to obtaining a representative extract that includes all the volatile compounds originally present in the wine. To achieve this, a fast and simple method based on ultrasound-assisted emulsification microextraction (USAEME) was developed for analyzing volatile compounds in wines. Chapter 1 presented the genetic and phenotypic diversity of S. cerevisiae populations at local, regional and global scales, highlighting how ecology and geography shape population structure. The comparison between indigenous and commercial strains of S. cerevisiae, particularly their impact on wine production, and the use of mixed yeast inocula as a means of diversifying wines and adding complexity to their sensory profiles was also discussed. Finally, in chapter 1 the analytical techniques used to determine the volatile fraction of wine were evaluated, and new approaches consistent with the trend toward green chemistry were proposed. In chapter 2, a simple, rapid, and efficient methodology for the analysis of the volatile fraction of white wines using ultrasound-assisted emulsification microextraction (USAEME) in conjunction with GC-FID was established. For this purpose, the primary factors influencing the recovery of the target compounds were investigated and optimized using experimental design and response surface methodology enhanced by the application of the desirability function. Once optimized, the satisfactory results obtained in terms of linearity, repeatability, detection, and quantification limits validated the method’s applicability for the analysis of volatile compounds in wine. The optimized method was effectively applied for the determination of volatile compounds in laboratory-scale fermentations with selected strains of S. cerevisiae. In chapter 3, the regional variability of S. cerevisiae phenotypes across four major viticultural regions in Greece was investigated. Differences in the phenotypic profiles of yeasts were also examined among vineyards within each region and between vintages. Our findings show that S. cerevisiae strains exhibit regional and temporal phenotypic variations in major wine quality attributes. Significant differences were detected among phenotypic profiles of S. cerevisiae strains of distinct viticultural regions. The viticultural region was the main factor driving variations in S. cerevisiae phenotypes. Significant differences were also observed between S. cerevisiae phenotypes from different vintages and to a lesser extent from different vineyards within a region. The results of chapter 3 were used in chapter 4, where two S. cerevisiae strains that represent regional genetic and phenotypic specificities for two major winegrowing areas of Greece were used in single- and mixed-culture fermentations. The chemical and sensory profiles of wines produced by single-cultures differed from one another and from those fermented by mixed-culture inoculum. The mixed-culture S. cerevisiae inoculum was shown to generate novel wine characteristics as compared to single-cultures, thus offering alternatives to further diversify wines and enhance their complexity.

Ενώ η βιογεωγραφία επικεντρώθηκε αρχικά στα φυτά και τα ζώα, πρόσφατες μελέτες επεκτείνουν τη θεωρία της βιογεωγραφίας για να συμπεριλάβουν τον μικροβιακό κόσμο, πράγμα που σημαίνει ότι διαφορετικά περιβάλλοντα μπορεί να φιλοξενούν διακριτικές μικροβιακές κοινότητες. Στην περίπτωση του οίνου, έρευνες δείχνουν ότι οι γεωγραφικά απομακρυσμένες αμπελουργικές περιοχές μπορεί να διαθέτουν γενετικά διακριτές μικροβιακές κοινότητες. Ωστόσο, μια σημαντική πτυχή για την οινοποίηση είναι εάν τέτοιες τοπικές κοινότητες ή πληθυσμοί μπορεί να οδηγήσουν σε διαφορετικούς οινικούς φαινοτύπους, υποστηρίζοντας έτσι τη έννοια του μικροβιακού terroir. Από όσο γνωρίζουμε, υπάρχει περιορισμένος αριθμός μελετών που έχει διερευνήσει εάν υπάρχει κάποια συσχέτιση μεταξύ της γεωγραφικής προέλευσης των στελεχών S. cerevisiae και των χαρακτηριστικά που παράγουν στον οίνο. Στα πλαίσια αυτά, ο κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός διαφορετικών στελεχών S. cerevisae μεγάλων αμπελουργικών περιοχών της Ελλάδα και να εκτιμήσει τις φαινοτυπικές διαφορές των περιφερειακών στελεχών S. cerevisiae. Για το σκοπό αυτό, χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά 226 διαφορετικά στελέχη S. cerevisiae που απομονώθηκαν από τέσσερις κύριες αμπελουργικές ζώνες της Ελλάδας, τη Σαντορίνη, τα Πεζά (Κρήτη) και δύο αμπελουργικές ζώνες στην Πελοπόννησο (Νεμέα και Μαντινεία). Το εκτενές σύνολο δεδομένων της παρούσας έρευνας, το οποίο περιλαμβάνει κινητικά και μεταβολικά που προσδιορίζονται κατά τη ζύμωση, παρέχει έναν ολοκληρωμένο άτλαντα της φαινοτυπικής ποικιλομορφίας του S. cerevisiae. Δεδομένου ότι οι πτητικές ενώσεις συμβάλλουν στον πλούτο του αρώματος του οίνου, η ποσοτική και ποιοτική μελέτη αυτών των ενώσεων έχει προσελκύσει σημαντικό ενδιαφέρον από την επιστημονική κοινότητα. Η προετοιμασία του δείγματος είναι καθοριστική για τη λήψη ενός αντιπροσωπευτικού εκχυλίσματος που περιλαμβάνει όλες τις πτητικές ενώσεις που υπήρχαν αρχικά στο κρασί. Για να επιτευχθεί αυτό, αναπτύχθηκε μια γρήγορη και απλή μέθοδος που βασίζεται στην μικροεκχύλιση μέσω γαλακτωματοποίησης με την βοήθεια υπερήχων (USAEME – ultrasound assisted emulsification microextraction) για την ανάλυση των πτητικών ενώσεων των οίνων. Στο κεφάλαιο 1 συζητήθηκε η γενετική και φαινοτυπική ποικιλομορφία των πληθυσμών του S. cerevisiae σε τοπική, περιφερειακή και παγκόσμια κλίμακα, αναδεικνύοντας τον ρόλο της οικολογίας και της γεωγραφίας στη διαμόρφωση της δομής του πληθυσμού. Συζητήθηκε επίσης η σύγκριση μεταξύ γηγενών και εμπορικών στελεχών S. cerevisiae, με έμφαση στον αντίκτυπό τους στην παραγωγή οίνου, καθώς και η χρήση μικτών εμβολίων ζυμών ως μέσο διαφοροποίησης των οίνων και ενίσχυσης της πολυπλοκότητας του αισθητηριακού τους προφίλ. Τέλος, στο κεφάλαιο 1 αξιολογήθηκαν οι αναλυτικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό του πτητικού κλάσματος του οίνου, ενώ προτάθηκαν νέες προσεγγίσεις που ευθυγραμμίζονται με την τάση προς την πράσινη χημεία. Στο κεφάλαιο 2, αναπτύχθηκε μια απλή, γρήγορη και αποτελεσματική μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πτητικών ενώσεων των οίνων χρησιμοποιώντας μικροεκχύλιση με γαλακτωματοποίηση υποβοηθούμενη από υπερήχους (USAEME) σε συνδυασμό με το GC-FID. Για τον σκοπό αυτό, οι κύριοι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάκτηση των στοχευόντων ενώσεων διερευνήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον πειραματικό σχεδιασμό και τη μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης, ενισχυμένες με την εφαρμογή της συνάρτησης επιθυμητότητας. Τα ικανοποιητικά αποτελέσματα που επιτευχθήκαν, μετά την βελτιστοποίηση της μεθόδου, από την άποψη της γραμμικότητας, της επαναληψιμότητας, των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης επικύρωσαν τη δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου για την ανάλυση πτητικών ενώσεων του οίνου. Η βελτιστοποιημένη μέθοδος εφαρμόστηκε αποτελεσματικά για τον προσδιορισμό των πτητικών ενώσεων σε ζυμώσεις εργαστηριακής κλίμακας με επιλεγμένα στελέχη S. cerevisiae. Στο κεφάλαιο 3, διερευνήθηκε η περιφερειακή μεταβλητότητα των φαινοτύπων S. cerevisiae από τέσσερις κύριες οινοπαραγωγικές περιοχές της Ελλάδας. Επιπλέον, εξετάστηκαν οι διαφορές στα φαινοτυπικά προφίλ των ζυμών μεταξύ των αμπελώνων κάθε περιοχής και μεταξύ των τρύγων. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι τα στελέχη S. cerevisiae παρουσιάζουν περιφερειακές και χρονικές φαινοτυπικές διαφοροποιήσεις στα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την ποιότητα του οίνου. Εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές στα φαινοτυπικά προφίλ των στελεχών S. cerevisiae των διαφορετικών οινοπαραγωγικών περιοχών. Η οινοπαραγωγική περιοχή είναι ο κύριος παράγοντας που καθορίζει τις διαφοροποιήσεις στους φαινότυπους του S. cerevisiae. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν επίσης μεταξύ των φαινοτύπων S. cerevisiae των διαφορετικών ετών συγκομιδής και, σε μικρότερο βαθμό, των διαφορετικών αμπελώνων εντός μιας περιοχής. Τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 2 χρησιμοποιήθηκαν στο κεφάλαιο 4, όπου δύο στελέχη S. cerevisiae που αντιπροσωπεύουν γονοτύπους με υψηλό ποσοστό επικράτησης στις αντίστοιχες οινοπαραγωγικές περιοχές και με θετικά οινολογικά χαρακτηριστικά χρησιμοποιήθηκαν σε ζυμώσεις μονών και μεικτών καλλιεργειών. Τα χημικά και αισθητηριακά χαρακτηριστικά των οίνων που παράγονται από μονές καλλιέργειες παρουσίασαν σημαντικές διαφορές τόσο μεταξύ τους όσο και σε σύγκριση με αυτά που ζυμώθηκαν με εμβόλια μεικτής καλλιέργειας. Η μεικτή καλλιέργεια αποδείχθηκε ότι προσδίδει νέα χαρακτηριστικά στον οίνο σε σύγκριση με τις μονές καλλιέργειες, προσφέροντας έτσι εναλλακτικές λύσεις για περαιτέρω διαφοροποίηση των οίνων και αύξηση της πολυπλοκότητάς τους.