Investigation of immobilization platforms for amine transaminases: design of enzymatic processes for chiral amine production

Abstract

The present doctoral thesis investigates the immobilization of amine transaminases (ATAs) on various platforms, with the goal of their use in chemoenzymatic cascades to produce chiral amines, essential in pharmaceuticals and fine chemicals. The study was divided into three key areas: the oxidative synthesis of acetophenone from cheap feedstock (corresponding alkyne, alcohol or alkane), screening immobilization strategies for ATAs, and integrating oxidation with transamination reactions. The oxidation step utilizing graphite oxide (GO) as catalyst underperformed, yielding conversions lower than expected, leading to the investigation of alternative pathways for this scope, such as photocatalysis and enzymatic oxidation. Immobilization strategies, however, provided valuable insights into enzyme stabilization and reuse. The core material used for immobilization (GO) was initially tested for its effect on various characteristics of the enzymes that were used, such as specific activity, operational stability and structural characteristics. Immobilization on GO came along with several challenges and commercial carriers were also introduced in the study, for comparison reasons. Immobilization on GO enhanced thermal stability, with the benchmark enzyme retaining up to 85% activity after exposure to elevated temperatures (60°C for 1 hour). Optimized conditions enabled the asymmetric synthesis of chiral amines like (S)-1-phenylethylamine with >99% enantioselectivity, though conversions fell below industrial requirements. In parallel with transaminases, reductive aminases (RedAms) were tested in several setups, to check the expansion of our workflow in different class of enzymes. Finally, the combination of oxidation and amination reactions within the envisioned cascade framework was unsuccessful, outlining the need for further optimization and investigation of further parameters of the whole process.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνά την ακινητοποίηση των αμινοτρανσαμινασών (ATAs) σε διάφορες πλατφόρμες, με στόχο τη χρήση τους σε χημειοενζυμικές αλληλουχίες για την παραγωγή χειρόμορφων αμινών, που είναι απαραίτητες στη φαρμακευτική και σε χημικά υψηλής αξίας. Η μελέτη χωρίστηκε σε τρεις κύριους τομείς: την οξειδωτική σύνθεση της ακετοφαινόνης από φθηνές πρώτες ύλες (αντίστοιχο αλκύνιο, αλκοόλη ή αλκάνιο), τη δοκιμή στρατηγικών ακινητοποίησης για τις ATAs και την ενσωμάτωση των αντιδράσεων οξείδωσης με τις αντιδράσειςτρανσαμίνωσης.Το στάδιο της οξείδωσης, που χρησιμοποίησε οξείδιο γραφίτη (GO) ως καταλύτη, παρουσίασε χαμηλή απόδοση, με χαμηλότερες από τις αναμενόμενες μετατροπές, οδηγώντας στη διερεύνηση εναλλακτικών μεθόδων για αυτό τον σκοπό, όπως η φωτοκατάλυση και η ενζυμική οξείδωση. Ωστόσο, οι στρατηγικές ακινητοποίησης προσέφεραν πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τη σταθεροποίηση και την επαναχρησιμοποίηση των ενζύμων. Το βασικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ακινητοποίηση (GO) δοκιμάστηκε αρχικά για την επίδρασή του σε διάφορα χαρακτηριστικά των χρησιμοποιούμενων ενζύμων, όπως η ειδική δραστικότητα, η λειτουργική σταθερότητα και τα δομικά χαρακτηριστικά. Η ακινητοποίηση στο GO συνοδεύτηκε από αρκετές προκλήσεις και εμπορικοί φορείς εισήχθησαν επίσης στη μελέτη για συγκριτικούς λόγους. Η ακινητοποίηση στο GO βελτίωσε τη θερμική σταθερότητα, με το πρότυπο ένζυμο να διατηρεί έως και 85% της δραστικότητάς του μετά από έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες (60°C για 1 ώρα). Οι βέλτιστες συνθήκες επέτρεψαν τη ασύμμετρη σύνθεση χειρόμορφων αμινών, όπως η (S)-1 φαινυλαιθυλαμίνη, με >99% ενζυμική εκλεκτικότητα, αν και οι μετατροπές ήταν κάτω από τις βιομηχανικές απαιτήσεις. Παράλληλα με τις τρανσαμινάσες, αναγωγικές αμινάσες (RedAms) δοκιμάστηκαν σε διάφορες διεργασίες για τη διερεύνηση της συνθετικής πορείας με διαφορετική κατηγορία ενζύμων. Τέλος, ο συνδυασμός αντιδράσεων οξείδωσης και αμίνωσης στο προτεινόμενο πλαίσιο αλληλουχίας δεν ήταν επιτυχής, υποδεικνύοντας την ανάγκη για περαιτέρω βελτιστοποίηση και διερεύνηση επιπλέον παραμέτρων της συνολικής διαδικασίας.