Διερεύνηση ανάπτυξης ικριωμάτων υδρογέλης μέσω τριδιάστατης εκτύπωσης και μεθοδολογιών βελτιστοποίησης των ενδιάμεσων σταδίων λαμβάνοντας υπόψη τις αρχές ακεραιτότητας στην έρευνα

Abstract

Direct Ink Writing (DIW), extensively utilized for developing robust 3D scaffolds crucial for the growth of targeted tissues, has gained prominence in biomedical applications. The creation of 3D structures involves four interconnected stages—material development, the printing process, post-printing treatment and cell seeding—each influenced by numerous factors, making the overall optimization challenging. This hypothesis is confirmed by the limited repeatability and reproducibility of the results of scaffold development via Direct Ink Writing. These issues stem from the fragmented nature of research efforts, the absence of integrated methodologies in experimental design, and the lack of standardization in terms, methods, and procedures. Additionally, the analysis revealed that several non-technical factors related to Research Integrity significantly contribute to the low reproducibility and reliability of results. The subject of this thesis is to optimize the development of three-dimensional alginate/gelatin hydrogel scaffolds using the Direct Ink Writing method. The intended application is in soft tissue engineering, focusing on achieving guided vascularization. This research systematically investigates all relevant parameters, including rheological properties, printing techniques, and processing conditions. The goal is to address the fundamental issue of low reproducibility in Translational Research, which stems from both technological limitations and Research Integrity issues. Initially, Principal Component Analysis (PCA) and K-means Clustering were employed to identify material properties with statistically significant correlations to printing efficiency. Subsequently, two Taguchi Design of Experiments (Taguchi DoE) were conducted to determine the optimal values for both primary and secondary printing settings to achieve precise printing accuracy. The findings from PCA were validated by K-means clustering, revealing that viscosity, m, G’, G’’ and yield stress are critical determinants of the material’s printing behavior. The application of Taguchi DoE resulted in a 92% strand printability and 85% pore area printability. The optimal printing settings for the configuration of the REGEMAT 3D printer were defined as follows: ink viscosity [1000-4000]Pas, n_index<1, m [1000-3000]Pasn, G’ [1500-4500]Pa, G’’[700-1500]Pa, yield stress [2000-5000]Pa (alginate ratio - 8%), print head temperature - 24°C, extrusion speed - 2mm/s, nozzle diameter – 0,41mm, layer height – 0,58 mm, perimeter speed - 3mm/s, infill speed - 2mm/s, retraction speed - 30mm/s, and travel speed - 50mm/s. For post-printing treatment, a high co-optimization (with a desirability score of 0,964) of two conflicting scaffold properties—degradation time (19,6days) and swelling rate (50%)—was achieved, approaching the target values of 21 days and 50%, respectively. The optimal post-printing conditions were determined as an alginate ratio of 8%, immersion time of 15min, cross-linker concentration of 0,284M, DMEM as the incubation medium, and UV exposure included. Finally, the thesis highlights the occurrence of Ethical Integrity Issues in the filed, often expressed through inconsistent or poorly justified results. Aiming to mitigate ethical concerns, a set of comprehensive guidelines for the standardization and handling of data and results is also suggested.

Η Άμεση Γραφή Μελάνης (Direct Ink Writing - DIW), η οποία αποτελεί μέθοδο Προσθετικής Κατασκευής (Additive Manufacturing – AM), χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάπτυξη λειτουργικών τριδιάστατων ικριωμάτων με γεωμετρία και δομική ακεραιότητα κατάλληλη για την ανάπτυξη ιστών-στόχων και έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος για εφαρμογές Ιστικής Μηχανικής. Η παραγωγή τριδιάστατων δομών περιλαμβάνει τέσσερις αλληλένδετες φάσεις: την ανάπτυξη υλικού, τη διαδικασία εκτύπωσης, τη μετα-εκτυπωτική επεξεργασία και τη σπορά κυττάρων. Πολυάριθμοι παράγοντες ελέγχουν τις τέσσερις αυτές φάσεις, καθιστώντας τη βελτιστοποίηση ολόκληρης της διαδικασίας ιδιαίτερα απαιτητική. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνεται από την περιορισμένη επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων της ανάπτυξης ικριωμάτων μέσω Άμεσης Γραφής Μελάνης, η οποία οφείλεται στην αποσπασματικότητα των ερευνητικών προσπαθειών, στην απουσία ολοκληρωμένων μεθοδολογιών στον πειραματικό σχεδιασμό, και, στην ελλιπή τυποποίηση όρων, μεθόδων και διαδικασιών. Τέλος, από την ανάλυση προέκυψε ότι μια σειρά μη τεχνικοί λόγοι που εντάσσονται στο πεδίο της Ηθικής και της Ακεραιότητας της Έρευνας αποτελούν εξίσου σημαντικούς παράγοντες χαμηλής αναπαραγωγιμότητας και αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων. Αντικείμενο της διατριβής είναι η βελτιστοποίηση της ανάπτυξης τριδιάστατων ικριωμάτων υδρογέλης αλγινικού/ζελατίνης με τη χρήση της μεθόδου της Άμεσης Γραφής Μελάνης με στοχευόμενη τελική εφαρμογή την ανάπτυξη μαλακών ιστών με δυνατότητα καθοδηγούμενης αγγείωσης. Η μεθοδολογική προσέγγιση που αναπτύχθηκε ερευνά το σύνολο των εμπλεκόμενων παραμέτρων (ρεολογικών, εκτύπωσης, επεξεργασίας) με τέτοιο τρόπο ώστε να αντιμετωπίζεται παράλληλα το θεμελιώδες πρόβλημα της χαμηλής αναπαραγωγιμότητας των αποτελεσμάτων κατά την μεταγραφική έρευνα. Εφαρμόστηκε αρχικά η Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (Principal Component Analysis – PCA) σε σύγκριση με την μέθοδο Ομαδοποίησης K-means (K- means Clustering) για τον προσδιορισμό των ιδιοτήτων του υλικού που εμφανίζουν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την αποτελεσματικότητα της εκτύπωσης. Στη συνέχεια εφαρμόστηκαν δύο διαδοχικοί Σχεδιασμοί Πειραμάτων Taguchi (Taguchi Design of Experiments – Taguchi DoE) για τον καθορισμό των τιμών των ρυθμίσεων εκτύπωσης (πρωτευουσών και δευτερευουσών) με στόχο την επίτευξη βέλτιστης ακρίβειας εκτύπωσης. Τα αποτελέσματα της PCA επιβεβαιώθηκαν από αυτά της ομαδοποίησης K-means και έδειξαν ότι το ιξώδες, το m, το G', το G'' και η τάση διαρροής καθορίζουν την εκτυπωτική συμπεριφορά των μειγμάτων, ενώ η εφαρμογή του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi οδήγησε σε εκτυπωσιμότητα νήματος 92% και εκτυπωσιμότητα της περιοχής των πόρων 85%. Τα βέλτιστα επίπεδα των ρυθμίσεων εκτύπωσης για τον 3D εκτυπωτή REGEMAT προσδιορίστηκαν ως εξής: μελάνι με ιξώδες [1000-4000]Pas, n_index<1, m [1000-3000]Pasn, G’ [1500-4500]Pa, G’’[700-1500]Pa, τάση διαρροής [2000-5000]Pa (αναλογία αλγινικού - 8%), θερμοκρασία κεφαλής εκτύπωσης - 24°C, ταχύτητα εξώθησης - 2mm/s, διάμετρος ακροφυσίου – 0,41mm, ύψος στρώματος – 0,58mm, ταχύτητα περιμέτρου - 3mm/s, ταχύτητα πλέγματος- 2mm/s, ταχύτητα ανάσυρσης - 30mm/s και ταχύτητα κίνησης - 50mm/s. Όσον αφορά στην μετα-εκτυπωτική επεξεργασία πραγματοποιήθηκε υψηλή συν-βελτίωση (με βαθμό επιθυμητότητας 0,964) δύο αντίθετα μεταβαλλόμενων ιδιοτήτων, του χρόνου αποδόμησης στις 19,6 ημέρες και του ποσοστού διόγκωσης στο 50%, με τιμές- στόχους τις 21 ημέρες και 50%, αντίστοιχα. Πιο συγκεκριμένα, οι βέλτιστες συνθήκες μετα-εκτυπωτικής επεξεργασίας είναι: αναλογία αλγινικού 8%, χρόνο εμβάπτισης 15min, συγκέντρωση διασυνδέτη 0,284M, μέσο επώασης DMEM και έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία.Τέλος, αποδείχθηκε ότι τα ζητήματα Ακεραιότητας στην Έρευνα στο πεδίο εκφράζονται τις περισσότερες φορές μέσω ασυνεπών ή και ηθελημένα «διαμορφωμένων» ερευνητικών αποτελεσμάτων σε τεχνικές παραμέτρους. Στη βάση αυτή, στη διατριβή προτείνεται μια συνολική προσέγγιση κατευθυντήριων γραμμών στο πεδίο της προτυποποίησης και της διαχείρισης των αποτελεσμάτων η οποία συμβάλλει στον περιορισμό των φαινομένων παραβίασης των αρχών της Ηθικής στην Έρευνα στο πεδίο.