Μοριακή οικολογία, γενετική και φυσιολογία της καραβίδας εσωτερικών υδάτων Pontastacus (Astacus) leptodactylus, και πιλοτική υδατοκαλλιέργεια του είδους

Abstract

In the context of the present doctoral thesis, many biological parameters were investigated included in the fields of ecology, genetics, physiology and growth of the species Pontastacus (Astacus) leptodactylus from a holistic point of view. Further, the experiments were conducted under the prism of the development of an aquaculture protocol for the species aiming not only the biodiversity preservation but also economic development in both local and national level.P. leptodactylus is a freshwater crayfish species included in the Astacidae family. It is an indigenous greek species, together with two other species, Astacus astacus and Austropotamobius torrentium, with their distribution characterized as “wide” in our country. However, due to its high economic value, P. leptodactylus populations have been transferred to many inland freshwater ecosystems in Greece, expanding its distribution range. Therefore, the first objective of the present thesis was to update the data concerning the geographical distribution of the species, combined with an attempt to study its genetics at both mitochondrial and population level (genetic composition of its populations using nuclear markers). Under this perspective, 15 new primer pairs were developed for mitochondrial genome amplification and its subsequent alignment and characterisation, providing useful results for the phylogenetic classification of the species. In addition, nine microsatellite markers were used, in order to assess the genetic structure and composition of five populations of the species (four from Greece and one from Turkey). From the results of the microsatellite analysis, it was observed that the three recently translocated Greek populations of the species (Volvi, Vegoritida, Polifitou lakes) revealed high similarity at genetic level not only among them but also with the Turkish population, insinuating their origin. On the contrary, the native population from Evros region was found genetically segregated, laying the foundations for the development of appropriate management practices based on the population genetic structure of the species. Following the study of the genetic composition and species distribution, the physiological parameters of the species were investigated in correlation to seasonality. More specifically, new primer pairs were developed, genes were characterized for the first time and protein expression levels were evaluated. The genes and proteins that were investigated were involved in heat shoch response, apoptosis, immune response and hypoxia pathways. More specifically, from the results was revealed that abiotic (temperature, turbidity), physiological (reproduction period, hatching) and immune-related (Aphanomyces astaci infection) factors possess a significant role on the mRNA expression and protein levels of the genes that were investigated. From the results of the present study, possible factors and periods that led to increased stress for the organism under natural conditions were identified leading to important outcomes towards the development of managemental practices related to conservation issues of the species. Following the ecological aspects related to the species, more practical issues related to its growth and overall wellbeing under laboratory conditions were investigated. More specifically, throughout the whole period that the present doctoral thesis was conducted P. leptodactylus individuals were kept under laboratory conditions participating in experimental procedures concerning their survival and growth indices. After their acclimatization, normal behaviors of the species were observed, including pleopodal egg production. Eggs were removed from the pleopods of the mother and separated into two developmental stages and incubated at two different temperatures. After the development of primer pairs targeting growth- related genes, such as the FGFR4 gene, their mRNA expression was investigated, leading to the observation that increasing temperature causes an increase in their expression in the early developmental stage while, on the contrary, leaves unaffected the expression of key-role genes related to efficient osmoregulation after hatching (Na+/K+-ATPase).Later, the newly hatched individuals were used for the needs of another one experimental set up concerning the development of a suitable diet for the newly hatched individuals of the species while at the same time complying with the principles of sustainable development. More analytically, three experimental diets were developed, two of which had a partial and total substitution of fishmeal with insect meal of the species Hermetia illucens. The results showed that while the individuals fed the insect-based diets had increased survival rates, they had an impaired growth performance and feed utilisation compared to the control group. In addition, it was observed that the substitution with insect meal affected the chemical composition and fatty acid profile of the individuals, suggesting that different metabolic pathways are probably enhanced in terms of its use by the organisms. Finally, factors dealing with the pathology of the species were investigated, especially after the observation of massive populations reductions in two lakes of Northern Greece (Vegoritida and Polifitou). After the molecular analysis, the pathogen A. astaci which is responsible for the crayfish plague disease was identified for the first time in our country. This pathogen is responsible for several epidemic outbreaks and extensive population declines in several crayfish species in European freshwater ecosystems. It seems that it has been transferred to the European continent through alien North American freshwater crayfish species (Pacifastacus leniusculus, Procambarus clarkii) which after recent recordings found to have established populations in Greece. However, the present thesis was not limited only to the detection and the genetic investigation of the pathogen. More specifically, non- invasive methods (DNA-swab and eDNA) were developed, where samples were collected from asymptomatic crayfish individuals with no clear signs of the disease (without harming the animal) and from the adjacent water where the pathogen was detected. However, no other potential host organisms of the pathogen were identified. In summary, in the present study, experimental procedures targeted the investigation of many biological parameters of the P. leptodactylus from a holistic point of view under the perspective of the future development of an aquaculture protocol for the species. Even though the thesis mainly focused on the Region of Western Macedonia as the populations with the largest size in our country and the highest commercial exploitation of the species are located there, the conclusions are considered useful for their extension throughout the Greek territory, expanding the horizons towards the local and national economic development while maintaining at a high priority the need to preserve both biodiversity and sustainability.

Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής διερευνήθηκαν πολλές βιολογικές παράμετροι που στοχεύουν στην ολιστική διερεύνηση της οικολογίας, της γενετικής, της φυσιολογίας αλλά και τους παράγοντες ανάπτυξης του Pontastacus (Astacus) leptodactylus υπό το πρίσμα της ανάπτυξης ενός πρωτοκόλλου υδατοκαλλιέργειας του είδους στοχεύοντας αφενός στη διατήρηση της βιοποικιλότητας αλλά και αφετέρου στην τοπική και εθνική οικονομική ανάπτυξη.Το είδος P. leptodactylus συγκαταλέγεται στην οικογένεια Astacidae της ομάδας των καραβίδων των εσωτερικών υδάτων. Αποτελεί αυτόχθονο είδος της Ελλάδας, μαζί με άλλα δύο είδη τα Astacus astacus και Austropotamobius torrentium και εμφανίζουν ευρεία εξάπλωση στη χώρα μας.Ωστόσο, λόγω της οικονομικής του σημασίας, πληθυσμοί του είδους P. leptodactylus έχουν μεταφερθεί σε πολλά ενδιαιτήματα εσωτερικών υδάτων στη χώρα μας διευρύνοντας το εύρος εξάπλωσής του. Πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν ως εκ τούτου η επικαιροποίηση των στοιχείων που αφορούν τη γεωγραφική κατανομή του είδους, ενώ επιπλέον επιχειρήθηκε και η μελέτη της γενετικής του σε επίπεδο μιτοχονδριακού DNA αλλά και σε επίπεδο γενετικής σύστασης των πληθυσμών του με χρήση πυρηνικών δεικτών. Για αυτό το λόγο, αναπτύχθηκαν 15 νέα ζεύγη εκκινητών τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του μιτοχονδρακού γονιδιώματος και συνέβαλαν στη στοίχιση και τον χαρακτηρισμό του παρέχοντας αποτελέσματα που διαλευκαίνουν τη φυλογενετική του ταξινόμηση. Επιπλέον, με τη χρήση εννέα μικροδορυφορικών δεικτών αναλύθηκε η γενετική σύσταση πέντε πληθυσμών του είδους (τεσσάρων από την Ελλάδα και ενός από την Τουρκία). Από τα αποτελέσματα της ανάλυσης των μικροδορυφόρων παρατηρήθηκε πως οι τρεις πρόσφατα μετατοπισμένοι ελληνικοί πληθυσμοί του είδους (λίμνες Βόλβη, Βεγορίτιδα, Πολυφύτου) παρουσιάζουν μεγάλο βαθμό γενετικής ομοιότητας με τον πληθυσμό της Τουρκίας, υποδηλώνοντας και την προέλευσή τους. Αντιθέτως, ο αυτόχθονος πληθυσμός του Έβρου διαχωρίστηκε γενετικά, θέτοντας τα θεμέλια για την ανάπτυξη κατάλληλων διαχειριστικών πρακτικών βάσει της πληθυσμιακής γενετικής δομής του είδους. Σε συνέχεια της μελέτης της γενετικής σύστασης και της εξάπλωσης του P. leptodactylus, διερευνήθηκαν και τα εποχικά πρότυπα φυσιολογίας του είδους. Πιο αναλυτικά αναπτύχθηκαν ειδικοί εκκινητές, χαρακτηρίστηκαν γονίδια και ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών για παράγοντες που εμπλέκονται σε μονοπάτια θερμικής καταπόνησης, υποξίας, ανοσολογικής απόκρισης και απόπτωσης. Πιο συγκεκριμένα, από τα αποτελέσματα φάνηκε πως αβιοτικοί (θερμοκρασία, θολερότητα), φυσιολογικοί (περίοδος αναπαραγωγής, έκδυσης) και ανοσολογικοί (προσβολή από τον παθογόνο ωομύκητα Aphanomyces astaci) παράγοντες επιδρούν στην έκφραση αλλά και την μετάφραση των εν λόγω γονιδίων. Από τα αποτελέσματα της παρούσας διερεύνησης, εντοπίστηκαν πιθανοί παράγοντες αλλά και περίοδοι αυξημένης καταπόνησης του είδους σε συνθήκες πεδίου και τέθηκαν τα θεμέλια με σκοπό την ανάπτυξη διαχειριστικών πρακτικών που αφορούν θέματα διατήρησης του είδους. Πέρα από τα θέματα που αφορούν την οικολογία του είδους διερευνήθηκαν και πιο πρακτικά ζητήματα που αφορούν την εκτροφή του είδους υπό εργαστηριακές συνθήκες. Συγκεκριμένα, καθ’ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής άτομα καραβίδας P. leptodactylus διατηρήθηκαν υπό εργαστηριακές συνθήκες για λόγους διεξαγωγής των πειραματικών διαδικασιών που αφορούσαν την επιβίωση και την ανάπτυξη τους. Μετά τον εγκλιματισμό τους παρατηρήθηκαν φυσιολογικές συμπεριφορές του είδους που συμπεριελάμβαναν και την παραγωγή αυγών. Τα αυγά διαχωρίστηκαν σε δύο αναπτυξιακά στάδια και επωάστηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Μετά τον σχεδιασμό και την ενίσχυση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη, όπως το γονίδιο FGFR4, παρατηρήθηκε πως η αύξηση της θερμοκρασίας προκαλεί την αύξηση της έκφρασής τους στο πρώιμο αναπτυξιακό στάδιο ενώ αντιθέτως αφήνει ανεπηρέαστη την έκφραση καθοριστικών γονιδίων που σχετίζονται με την αποτελεσματική ωσμορύθμιση μετά την εκκόλαψη (Νa+/K+-ATPασης). Σε επόμενο στάδιο, τα νεοεκκολαπτόμενα άτομα χρησιμοποιήθηκαν για τις ανάγκες ακόμα μίας πειραματικής διερεύνησης που αφορούσε την ανάπτυξη κατάλληλου σιτηρεσίου για τα νεοεκκολαπτόμενα άτομα του είδους ενώ ταυτόχρονα συμμορφώνεται με τις αρχές της βιώσιμης ανάπτυξης. Πιο αναλυτικά, αναπτύχθηκαν τρία πειραματικά σιτηρέσια, δύο εκ των οποίων είχαν μερική ή ολική υποκατάσταση του ιχθυαλεύρου από άλευρο του εντόμου Hermetia illucens. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως ενώ τα άτομα που διατράφηκαν με τα σιτηρέσια υποκατάστασης είχαν αυξημένα ποσοστά επιβίωσης, οι παράμετροι σωματικής αύξησης και αποδοτικότητας της τροφής μειώθηκαν σημαντικά συγκριτικά με εκείνες του μάρτυρα. Επιπλέον, φάνηκε πως η υποκατάσταση με εντομοάλευρο επηρέασε τη χημική σύσταση και το προφίλ λιπαρών οξέων του σώματος των ατόμων, υποδηλώνοντας πως πιθανώς ακολουθούνται διαφορετικές μεταβολικές οδοί ως προς την χρήση του από τους οργανισμούς.Τέλος, διερευνήθηκαν παράγοντες της παθολογίας του είδους, ειδικά μετά από την παρατήρηση μαζικών μειώσεων των πληθυσμών σε δύο λίμνες της Βόρειας Ελλάδας (Βεγορίτιδα και Πολυφύτου). Μετά την μοριακή ανάλυση εντοπίστηκε επίσημα για πρώτη φορά στη χώρα μας ο παθογόνος μικροοργανισμός A. astaci που είναι υπεύθυνος για την ασθένεια της πανώλης της καραβίδας. Ο συγκεκριμένος παθογόνος μικροοργανισμός έχει προκαλέσει επιδημικές εξάρσεις και εκτεταμένες μειώσεις πληθυσμών σε πολλά είδη καραβίδας των εσωτερικών υδάτων της Ευρώπης. Φαίνεται πως έχει μεταφερθεί στην ευρωπαϊκή ήπειρο μέσω ξενικών ειδών της βόρειας Αμερικής (Pacifastacus leniusculus, Procambarus clarkii) τα οποία μετά από πρόσφατες καταγραφές έχουν εγκαθιδρυμένους πληθυσμούς στην Ελλάδα. Ωστόσο η παρούσα διατριβή δεν περιορίστηκε μόνο στην διερεύνηση του εντοπισμού του παθογόνου. Πιο αναλυτικά, αναπτύχθηκαν μη επεμβατικές μέθοδοι (DNA-swab και eDNA), όπου συλλέχθηκαν δείγματα από ασυμπτωματικά άτομα καραβίδας και από το παρακείμενο νερό της λίμνης όπου και ανιχνεύτηκε ο ωομύκητας A. astaci. Εντούτοις, δεν εντοπίστηκαν άλλοι πιθανοί οργανισμοί ξενιστές της νόσου. Συνοψίζοντας, στην παρούσα μελέτη διενεργήθηκαν πειραματικές διαδικασίες που στόχευαν την ολιστική προσέγγιση των βιολογικών παραμέτρων του είδους P. leptodactylus υπό το πρίσμα της μελλοντικής ανάπτυξης ενός πρωτοκόλλου υδατοκαλλιέργειας τους. Παρόλο που η διατριβή επικεντρώθηκε στην Περιφέρεια της Δυτικής Μακεδονίας καθώς εκεί εντοπίζονται οι πληθυσμοί με το μεγαλύτερο μέγεθος στην χώρα μας και η υψηλότερη εμπορική αξιοποίηση του είδους, τα συμπεράσματα κρίνονται χρήσιμα για την επέκταση τους σε όλο το εύρος της ελληνικής επικράτειας ανοίγοντας νέους ορίζοντες προς την τοπική και εθνική οικονομική ανάπτυξη διατηρώντας ταυτόχρονα σε υψηλή προτεραιότητα την ανάγκη για διατήρηση της βιοποικιλότητας και της βιώσιμης οικονομίας.