Σύγχρονη φαρμακογνωστική μελέτη του ενδημικού είδους Origanum dictamnus L. Έλεγχος ποιότητας των ειδών Salvia rosmarinus (L.) Schleid και Salvia officinalis L.

Abstract

The species Origanum dictamnus L., known as "dittany," has been used since antiquity for the treatment of gastrointestinal and gynecological disorders, as well as for wound healing. Today, the plant is registered by the EMA as a Traditional Herbal Medicinal Product and is indicated for the treatment of cough, relief from gastrointestinal disturbances, and wound healing. In Crete, where dittany is an endemic species, it is widely used in the form of infusions and decoctions to address gastrointestinal discomfort, as a topical healing agent, and for dysmenorrhea, holding a unique significance in local tradition. Extensive chromatographic separations were conducted initially to thoroughly investigate the plant's chemical composition. A metabolomic approach was employed, ensuring both the rapid identification of known metabolites (dereplication) and the detection of target natural products and new natural compounds. This was achieved by combining two analytical techniques, NMR and HPLC-PDA-MS, alongside classical TLC, applied at each stage of the process. Chromatographic isolations were performed on the aerial parts and, for the first time, on the roots, while the chromatographic profile of dittany infusion was also studied via HPLC-PDA-MS. A total of 44 compounds were isolated/detected, eight of which were spectroscopically characterized for the first time. The structures were elucidated using 1D- and 2D-NMR spectroscopy and, where necessary, circular dichroism. The compounds described for the first time include I4-II7-di-carvacrol (4) (Paloukopoulou et al., 2022), abietatriene-3β,6β-diol (5), 2′′′-caffeoyl-apigenin-7-O-β-glucuronopyranoside (24), apigenin-7-O-[2′′′-caffeoyl-glucuronopyranosyl-(1→2)]-O-glucuronopyranoside (25), luteolin-7-O-[2′′′-caffeoyl-glucuronopyranosyl-(1→2)]-O-glucuronopyranoside (26), apigenin-7-O-[2′′′-feruloyl-glucuronopyranosyl-(1→2)]-O-glucuronopyranoside (27), luteolin-7-O-[2′′′-feruloyl-glucuronopyranosyl-(1→2)]-O-glucuronopyranoside (28), and the depside dittany acid (37).Subsequently, in vitro studies were conducted to evaluate the antibacterial, antifungal, and anticancer activities of these compounds. The impetus for investigating their antimicrobial properties stemmed from ethnopharmacological references citing the use of the herb for throat pain relief during colds, as well as from literature focusing primarily on essential oils. The antibacterial activity of the compounds was assessed against bacterial strains such as Staphylococcus aureus (methicillin-resistant) and Pseudomonas aeruginosa (carbapenem-resistant). Additionally, since previous studies have shown that phenolic compounds can act as carbonic anhydrase inhibitors, a broader range of phenolic structures from Origanum dictamnus was investigated for their inhibitory effect against the fungal β-MgCA and their antifungal activity against the strain Malassezia globosa. The plant's depsides salvianolic acid P and dittany acid were studied for their inhibition of the cancer-associated human carbonic anhydrase isoforms hCA IX and XII. The compounds demonstrated significant inhibitory activity against hCA IX and effectively inhibited the second isoform hCA XII as well. The binding mode of the ligands to the enzyme was studied using crystallography, which revealed that salvianolic acid P binds by creating multiple stabilizing interactions both within the active site and at the boundaries of the enzyme structure. Finally, the compounds were evaluated for cytotoxicity against a standard human cell line from triple-negative breast cancer (MDA-MB-231) and showed significant cytotoxic activity. Considering the ethnopharmacological use of the plant for gastrointestinal disorders, preliminary experiments were conducted on isolated rabbit intestines, which showed the relaxing effect of dittany infusion. This prompted further investigation into how dittany's constituents are affected by digestive processes during oral administration of the infusion. The following experiments were conducted: (i) ex vivo intestinal permeability evaluation, (ii) in vitro simulated digestion in three phases (oral, gastric, and intestinal), and (iii-iv) stability testing of the infusion in the presence/absence of intestinal tissue. Such data are not included in the official European Community Monograph. The infusion was prepared according to the EMA dosage scheme. The ex vivo permeability experiment was conducted using the non-everted gut sac method on jejunum from rabbit intestines. Each intestinal sac was filled with dittany infusion and placed in glass containers in a water bath at 37 °C. Samples from the perintestinal solution were collected at designated times and analyzed via HPLC-PDA-MS. The in vitro digestion study was conducted in three stages, evaluating enzyme activity: (i) amylase (oral phase), (ii) pepsin in the presence of HCl at pH 2 (gastric phase), (iii) pancreatin and trypsin, as well as bile salts at pH 6.5 (intestinal phase). The permeability test showed that salvianolic acid P derivative 1 exhibited the highest permeability, reaching 12.59 μg/cm². The in vitro digestion study revealed that the infusion's constituents undergo enzymatic breakdown during both gastric and intestinal phases, with the effect being more pronounced in the intestinal phase. Under experimental conditions simulating the intestinal environment (e.g., buffer solution, temperature, and oxygen levels), lignans showed the highest breakdown, reaching 50–60%, while further breakdown was observed for all compounds in the presence of intestinal tissue, with the depside 9 (salvianolic acid P derivative 2) nearing 78%. This degradation trend was common for components containing ester groups. The EMA references to the sedative effect of dittany infusion on the gastrointestinal system and its dual action as both abortive and antispasmodic led to the scientific investigation of these claims. Notably, there are no modern data proving this activity. To address this gap, the pharmacodynamic action of dittany infusion on isolated rabbit intestines was studied. The experiments were conducted on preparations from segments of the small (jejunum) and large intestine (ascending colon). Concurrently, the infusion was quantitatively analyzed using HPLC-PDA-MS to correlate its chemical composition with the pharmacological response. Dittany infusion caused dose-dependent relaxation in rabbit intestines, reducing both the frequency and amplitude of contractions, as well as the basal tone of the ascending colon and jejunum preparations, with the ascending colon being more sensitive. Thus, the ethnopharmacological use of the plant is scientifically confirmed. Additionally, our experiments indicate that non-volatile, water-soluble, phenolic components are responsible for this relaxing effect. Pilot experiments conducted on rabbit intestinal preparations showed that rosmarinic acid, at much lower concentrations compared to those in dittany, had a relaxing effect on both the jejunum and ascending colon. However, the presence of other depsides in significant concentrations in the infusion, as indicated by its percentage composition, suggests that the remaining compounds also warrant pharmacodynamic investigation. Based on the results of dittany's action on the intestine, it was decided to further formulate it into innovative pharmaceutical forms intended for oral administration. The design of films encapsulating dittany infusion was selected. Initially, rosmarinic acid, the infusion's main metabolite, was quantitatively determined and served as a marker for characterizing the preparation. Subsequently, the infusion was formulated with polyvinyl alcohol and chitosan into films via electrospinning. The produced films were characterized for their physicochemical properties, while their infusion content proved satisfactory and industrially viable, ranging from 88.7–90.0% and 82.6–85.8% of rosmarinic acid. Finally, both the films and the infusion showed no cytotoxic action, demonstrating their safe use. In the final part of the doctoral thesis, a methodology was developed for the determination of carnosic acid and carnosol in fresh rosemary and sage leaves using HPLC-PDA. The study was conducted as part of the BIOPHARM program aimed at identifying Greek genotypes producing high amounts of carnosic acid. A rapid RP-HPLC protocol was developed and further optimized, while the methodology was validated for precision and accuracy according to ICH guidelines. The overall method's accuracy (extraction and HPLC) was acceptable, with %RSD values ranging between 1.42 and 4.35. Recovery ranged between 85.1% and 104.6%, with %RSD values <5%, within acceptable limits. The developed methodology was fast and simple, allowing for the rapid and accurate determination of carnosic acid and carnosol in fresh tissues. The methodology was applied to the quantitative analysis of several cultivated samples of S. rosmarinus and S. officinalis, some of which demonstrated good quality as starting materials for developing Greek genotypes rich in carnosic acid.

Το είδος Origanum dictamnus L., γνωστό ως «δίκταμο», έχει χρησιμοποιηθεί από την αρχαιότητα για την αντιμετώπιση γαστρεντερικών και γυναικολογικών διαταραχών, καθώς και για την επούλωση πληγών. Σήμερα, το φυτό είναι καταχωρισμένο από τον ΕΜΑ ως Φυτικό Φαρμακευτικό Προϊόν Παραδοσιακής Χρήσης, και ενδείκνυται για την αντιμετώπιση του βήχα, την ανακούφιση από γαστρεντερικές διαταραχές και την επούλωση τραυμάτων. Στην Κρήτη, όπου το δίκταμο είναι ενδημικό είδος, χρησιμοποιείται ευρέως με τη μορφή εγχυμάτων και αφεψημάτων για την αντιμετώπιση των γαστρεντερικών ενοχλήσεων, ως επουλωτικό εξωτερικά και κατά της δυσμηνόρροιας, έχοντας ξεχωριστή σημασία στην τοπική παράδοση. Σε πρώτο στάδιο έγιναν εκτεταμένοι χρωματογραφικοί διαχωρισμοί προκειμένου να διερευνηθεί εις βάθος το χημικό περιεχόμενο του φυτού. Για το σκοπό αυτό ακολουθήθηκε μια μεταβολομική προσέγγιση που εξασφάλιζε, αφενός τη γρήγορη ταυτοποίηση γνωστών μεταβολιτών (dereplication), αφετέρου την ανίχνευση φυσικών προϊόντων-στόχων και τον εντοπισμό νέων φυσικών προϊόντων. Αυτό επιτεύχθηκε με το συνδυασμό δύο αναλυτικών τεχνικών, NMR και HPLC-PDA-MS, εκτός από την κλασική TLC, οι οποίες εισήχθησαν σε κάθε στάδιο της διαδικασίας. Πραγματοποιήθηκαν χρωματογραφικές απομονώσεις στα υπέργεια τμήματα και για πρώτη φορά στις ρίζες, ενώ μελετήθηκε και το χρωματογραφικό προφίλ του εγχύματος δικτάμου μέσω HPLC-PDA-MS. Συνολικά απομονώθηκαν/ανιχνεύθηκαν 44 ενώσεις, εκ των οποίων οκτώ δομές προσδιορίστηκαν φασματοσκοπικά για πρώτη φορά. Οι δομές διευκρινίστηκαν με φασματοσκοπία 1D- και 2D-NMR και όπου κρίθηκε σκόπιμο με κυκλικό διχρωισμό. Οι ενώσεις που περιγράφονται για πρώτη φορά είναι οι I4-II7-δι-καρβακρόλη (4) (Paloukopoulou et al., 2022), αβιετατριενο-3β,6β-διόλη (5), 2′′′-καφεουλο-απιγενινο-7-O-β-γλυκουρονοπυρανοσίδης (24), απιγενινο-7-Ο-[2′′′-καφεοϋλο-γλυκουρονοπυρανοσυλο-(1→2)] -Ο-γλυκουρονοπυρανοσίδης (25), λουτεολινο-7-Ο-[2′′′-καφεοϋλο-γλυκουρονοπυρανοσυλο-(1→2)]-Ο-γλυκουρονοπυρα νοσίδης (26), απιγενινο-7-O-[2′′′-φερουλοϋλο-γλυκουρονοπυρανοσυλο-(1→2)]-Ο-γλυκουρονοπυρανοσίδης (27), λουτεολινο-7-O-[2′′′-φερουλοϋλο-γλυκουρονοπυρανο συλο-(1→2)]-Ο-γλυκουρονοπυρανοσίδης (28) και το δεψίδιο διττανικό οξύ (37). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες για την αντιβακτηριακή, αντιμυκητιασική και αντικαρκινική δράση των ενώσεων. Η αφορμή για την εξέταση της αντιμικροβιακής τους δράσης προήλθε από τις εθνοφαρμακολογικές αναφορές που αναφέρουν τη χρήση της δρόγης για την ανακούφιση από τον πονόλαιμο σε κρυολόγημα, καθώς και από τη βιβλιογραφία που επικεντρώνεται κυρίως στα αιθέρια έλαια. Η αντιβακτηριακή δράση των ενώσεων αξιολογήθηκε σε βακτηριακά στελέχη όπως το Staphylococcus aureus (ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη) και το Pseudomonas aeruginosa (ανθεκτικό στις καρβαπενέμες). Επιπλέον, δεδομένου ότι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι φαινολικές ενώσεις μπορούν να λειτουργούν ως αναστολείς της καρβονικής ανυδράσης, διερευνήθηκε μια ευρύτερη ποικιλία φαινολικών δομών του Origanum dictamnus για την ανασταλτική τους δράση έναντι της μυκητιασικής β-MgCA, καθώς και την αντιμυκητιασική τους δράση κατά του στελέχους Malassezia globosa. Τα δεψίδια του φυτού σαλβιανολικό οξύ P και διττανικό οξύ μελετήθηκαν για την αναστολή τους έναντι των σχετιζόμενων με καρκίνο ανθρώπινων ισομορφών hCA IX και XII, της καρβονικής ανυδράσης. Οι ενώσεις έδειξαν σημαντική ανασταλτική δράση κατά της ισομορφής hCA IX, ενώ ανέστειλαν αποτελεσματικά και τη δεύτερη ισομορφή hCA XII. Ο τρόπος δέσμευσης των προσδετών στο ένζυμο, μελετήθηκε μέσω κρυσταλλογραφίας και έδειξε ότι το σαλβιανολικό οξύ P συνδέεται δημιουργώντας πολλές σταθεροποιητικές αλληλεπιδράσεις, τόσο μέσα στο ενεργό κέντρο, όσο και στα όρια της δομής του ενζύμου. Τέλος, οι ενώσεις αξιολογήθηκαν για την κυτταροτοξικότητά τους σε πρότυπη ανθρώπινη κυτταρική σειρά από τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού (MDA-MB-231), και παρουσίασαν σημαντική κυτταροτοξική δράση. Λαμβάνοντας υπόψη την εθνοφαρμακολογική χρήση του φυτού στις γαστρεντερικές διαταραχές, διεξήχθησαν προκαταρκτικά πειράματα με απομονωμένο έντερο κουνελιού, τα οποία έδειξαν τη χαλαρωτική δράση του εγχύματος δικτάμου. Αυτό μας ώθησε στο να εξετάσουμε τον τρόπο που τα συστατικά του δικτάμου επηρεάζονται από τις πεπτικές διεργασίες στην από του στόματος χορήγηση του εγχύματος. Για τον σκοπό αυτό, διεξήχθησαν οι ακόλουθοι πειραματισμοί: i) ex vivo αξιολόγηση εντερικής διαπερατότητας, ii) in vitro προσομοίωση πέψης στις τρεις φάσεις (στοματική, γαστρική και εντερική) και iii-iv) έλεγχος σταθερότητας του εγχύματος παρουσία/απουσία του εντερικού ιστού. Τέτοιου είδους δεδομένα δεν περιλαμβάνονται στην επίσημη Μονογραφία της Ευρωπαϊκής Κοινότητας. Το έγχυμα παρασκευάστηκε σύμφωνα με το σχήμα δοσολογίας του EMA. Το ex vivo πείραμα διαπερατότητας πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του μη ανεστραμμένου εντερικού σάκου (non-everted gut sac method) σε νήστιδα από έντερο κουνελιού. Κάθε εντερικός σάκος πληρώθηκε με έγχυμα δικτάμου, και τοποθετήθηκε σε γυάλινους περιέκτες σε υδατόλουρο στους 37 °C. Δείγματα από το περιεντερικό διάλυμα συλλέχθηκαν σε καθορισμένους χρόνους και αναλύθηκαν με HPLC-PDA-MS. Η μελέτη της in vitro πέψης πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια, και έγινε αξιολόγηση της δραστικότητας των ενζύμων: i) της αμυλάσης (στοματική φάση), ii) της πεψίνης παρουσία HCl σε pH 2 (γαστρική φάση), iii) της παγκρεατίνης και θρυψίνης, καθώς και των χολικών αλάτων σε pH 6,5 (εντερική φάση). Ο έλεγχος της εντερικής διαπερατότητας έδειξε ότι το παράγωγο 1 του Σαλβιανολικού οξέος P εμφάνισε την υψηλότερη διαπερατότητα, φτάνοντας τα 12,59 μg/cm2. Στη μελέτη in vitro πέψης διαπιστώθηκε ότι τα συστατικά του εγχύματος υφίστανται ενζυμική διάσπαση, τόσο στη γαστρική, όσο και στην εντερική φάση, με το αποτέλεσμα να είναι πιο έντονο στην εντερική φάση. Στις πειραματικές συνθήκες που προσομοιώνουν το εντερικό περιβάλλον (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα, θερμοκρασία και επίπεδα οξυγόνου), τα λιγνάνια παρουσίασαν την υψηλότερη διάσπαση, φτάνοντας σε ποσοστό 50-60%, ενώ παρουσία του εντερικού ιστού παρατηρείται περαιτέρω διάσπαση για όλες τις ενώσεις με το δεψίδιο 9 (παράγωγο 2 του Σαλβιανολικού οξέος P) να πλησιάζει το 78%. Αυτή η τάση αποικοδόμησης ήταν κοινή στα συστατικά που περιείχαν εστερικές ομάδες. Οι αναφορές του ΕΜΑ για την ηρεμιστική δράση του εγχύματος δικτάμου στο γαστρεντερικό σύστημα και του διττού τρόπου δράσης του, τόσο ως εκτρωτικό, όσο και ως σπασμολυτικό, μας οδήγησαν στην επιστημονική διερεύνηση αυτών των αναφορών. Είναι χαρακτηριστικό ότι δεν υπάρχουν σύγχρονα δεδομένα που να αποδεικνύουν τη δράση αυτή. Προκειμένου να καλυφθεί το κενό αυτό, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η φαρμακοδυναμική δράση εγχύματος δικτάμου στο απομονωμένο έντερο κουνελιού. Οι πειραματισμοί πραγματοποιήθηκαν σε παρασκευάσματα από μοίρες του λεπτού (νήστιδα) και του παχέος εντέρου (ανιόν κόλον). Παράλληλα, το έγχυμα αναλύθηκε ποσοτικά μέσω HPLC-PDA-MS προκειμένου να συνδεθεί η χημική του σύσταση με τη φαρμακολογική απόκριση. Το έγχυμα του δικτάμου προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη χαλάρωση στο έντερο κουνελιού, καθώς μείωσε, τόσο τη συχνότητα και το εύρος των συσπάσεων, όσο και τον βασικό τόνο των παρασκευασμάτων του ανιόντος κόλου και της νήστιδας, με το ανιόν κόλον να εμφανίζεται πιο ευαίσθητο. Έτσι επιβεβαιώνεται επιστημονικά η εθνοφαρμακολογική χρήση του φυτού. Επιπλέον, τα πειράματά μας δείχνουν ότι τα μη πτητικά, υδατοδιαλυτά, φαινολικά συστατικά είναι υπεύθυνα για αυτό το χαλαρωτικό αποτέλεσμα. Πιλοτικά πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε εντερικά παρασκευάσματα κουνελιού έδειξαν ότι το ροσμαρινικό οξύ, σε συγκεντρώσεις πολύ χαμηλότερες συγκριτικά με αυτές του δικτάμου, είχε μια χαλαρωτική επίδραση, τόσο στη νήστιδα, όσο και στο ανιόν κόλον. Όμως, η παρουσία και άλλων δεψιδίων σε αρκετά μεγάλη συγκέντρωση στο έγχυμα, όπως μαρτυρά η ποσοστιαία σύσταση αυτού, υποδεικνύουν ότι και οι υπόλοιπες ενώσεις χρήζουν φαρμακοδυναμικής διερεύνησης. Με βάση τα αποτελέσματα της δράσης του δικτάμου στο έντερο, αποφασίστηκε η περαιτέρω μορφοποίηση σε καινοτόμες φαρμακοτεχνικές μορφές προοριζόμενες για per os χορήγηση. Επιλέχθηκε ο σχεδιασμός υμενίων με ενθυλακωμένο το έγχυμα δικτάμου. Προς τούτο, αρχικά προσδιορίστηκε ποσοτικά το ροσμαρινικό οξύ, που είναι ο κύριος μεταβολίτης του εγχύματος, και χρησίμευσε ως δείκτης για τον χαρακτηρισμό του παρασκευάσματος. Ακολούθως το έγχυμα μορφοποιήθηκε με πολυβινυλική αλκοόλη και χιτοζάνη σε υμένια μέσω της μεθόδου της ηλεκτροϊνοποίησης. Τα παραχθέντα υμένια χαρακτηρίστηκαν για τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, ενώ η περιεκτικότητά τους σε έγχυμα αποδείχθηκε ικανοποιητική και βιομηχανικά βιώσιμη, κυμαινόμενη από 88,7 – 90,0% και 82,6 – 85,8% ροσμαρινικού οξέος. Τέλος, τόσο τα υμένια, όσο και το έγχυμα δεν παρουσίασαν καμία κυτταροτοξική δράση αποδεικνύοντας την ασφαλή χρήση τους. Στο τελευταίο τμήμα της διδακτορικής διατριβής ασχοληθήκαμε με την ανάπτυξη μεθοδολογίας HPLC-PDA για τον προσδιορισμό του καρνοσικού οξέος και της καρνοσόλης στα φρέσκα φύλλα δενδρολίβανου και φασκόμηλου. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του προγράμματος ΒΙΟΦΑΡΜ με στόχο τον εντοπισμό γενότυπων ελληνικού που να παράγουν υψηλές ποσότητες καρνοσικού οξέος. Αναπτύχθηκε ένα γρήγορο πρωτόκολλο RP-HPLC το οποίο βελτιστοποιήθηκε περαιτέρω, ενώ η μεθοδολογία επικυρώθηκε για πιστότητα και ακρίβεια σύμφωνα με τις οδηγίες του ICH. Η πιστότητα της συνολικής μεθόδου (εκχύλιση και HPLC) ήταν αποδεκτή με % τιμές RSD που κυμαίνονταν μεταξύ 1,42 και 4,35. Η ανάκτηση κυμάνθηκε μεταξύ 85,1% και 104,6% με τιμές RSD < 5%, εντός των αποδεκτών ορίων. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε ήταν γρήγορη και απλή και επέτρεψε τον γρήγορο και ακριβή προσδιορισμό του καρνοσικού οξέος και της καρνοσόλης στους φρέσκους ιστούς. Η μεθοδολογία εφαρμόστηκε στην ποσοτική ανάλυση αρκετών καλλιεργημένων δειγμάτων S. rosmarinus και S. officinalis και ορισμένα από αυτά έδειξαν ότι είναι καλής ποιότητας αρχικά υλικά για την ανάπτυξη ελληνικών γενότυπων πλούσιων σε καρνοσικό οξύ.