Σχεδιασμός, σύνθεση και διαμορφωτική μελέτη αναλόγων της εκλυτικής ορμόνης των γοναδοτροπινών (Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH) που εμπλέκονται στον ορμονοεξαρτώμενο καρκίνο

Abstract

The gonadotropin releasing hormone (GnRH or LHRH) is a decapeptide that regulates the secretion of gonadotropins FSH and LH and the function of the reproductive axis. Changes in its activity are associated with fertility problems and hormone-dependent cancers, which are characterized by a high number of GnRH receptors (GnRHR). One treatment approach involves administering modified GnRH peptide analogues, with short half-lives due to proteolytic degradation. Another therapeutic approach is the administration of cytotoxic compounds that act powerfully and effectively but are associated with serious side effects. The scientific community focuses on developing a targeted therapy with improved efficacy and reduced side effects. In this doctoral dissertation, the design and synthesis of GnRH peptide analogues with agonistic and antagonistic actions were carried out. The carboxy-terminal of the agonistic analogues was modified based on the sequence of Leuprolide, while the antagonistic analogue was synthesized based on the sequence of Cetrorelix. At position 6 of the peptide analogues, D-configuration amino acids with modified side chains were used to insert a thiol group into the molecule. Additionally, analogues of the cytotoxic compound mitoxantrone were designed and synthesized, including a thiol group. The target of this dissertation was the synthesis of conjugates consisting of a GnRH peptide analogue and a mitoxantrone analogue, linked via a disulfide bond. The aim of these conjugates is the GnRH peptide analogue to bind to the GnRH receptor and release the mitoxantrone analogue after the reduction of the disulfide bond using the thioredoxin system. A structural study was performed using Molecular Modelling techniques for the agonistic GnRH peptide analogues and their corresponding conjugates. Furthermore, all analogues were studied using 1D and 2D Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. The studies provided significant information about the conformation of the analogues. The most promising conjugate was studied for its ability to reduce the disulfide bond by the thioredoxin system and its stability during long-term storage in different forms (liquid/solid) and temperatures.

Η εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών (GnRH ή LHRH) αποτελεί ένα δεκαπεπτίδιο που ρυθμίζει την έκκριση των γοναδοτροπινών FSH και LH αλλά και τη λειτουργία του αναπαραγωγικού άξονα. Μεταβολές στη δράση της σχετίζονται με προβλήματα γονιμότητας και ορμονοεξαρτώμενους καρκίνους στους οποίους παρατηρείται μεγάλος αριθμός των υποδοχέων της GnRH (GnRHR). Μία από τις υπάρχουσες θεραπείες είναι η χορήγηση τροποποιημένων πεπτιδικών αναλόγων της GnRH που παρουσιάζουν μικρό χρόνο ημιζωής λόγω της πρωτεολυτικής αποικοδόμησης που υφίστανται. Μία άλλη θεραπευτική λύση είναι η χορήγηση κυτταροτοξικών ουσιών που δρουν ισχυρά και αποτελεσματικά, αλλά χαρακτηρίζονται από την εμφάνιση σοβαρών παρενεργειών. Το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας επικεντρώνεται στην ανάπτυξη μίας στοχευμένης θεραπείας με βελτιωμένη αποτελεσματικότητα και μειωμένες παρενέργειες.Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων της GnRH με αγωνιστική και ανταγωνιστική δράση. Το καρβοξυ-τελικό άκρο των αγωνιστικών αναλόγων τροποποιήθηκε σύμφωνα με την αλληλουχία του Leuprolide, ενώ το ανταγωνιστικό ανάλογο συντέθηκε βασιζόμενο στην αλληλουχία του Cetrorelix. Στη θέση 6 των πεπτιδικών αναλόγων χρησιμοποιήθηκαν αμινοξέα D-διαμόρφωσης με τροποποιημένη πλάγια αλυσίδα, ώστε να ενσωματωθεί στο μόριο μία θειολομάδα. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση αναλόγων της κυτταροτοξικής ένωσης μιτοξανδρόνης με σκοπό την εισαγωγή μίας θειολομάδας. Ο απώτερος στόχος της διδακτορικής διατριβής ήταν η σύνθεση συζευγμάτων αποτελούμενων από ένα πεπτιδικό ανάλογο της GnRH και ένα ανάλογο της μιτοξανδρόνης συνδεδεμένων μέσω δισουλφιδικού δεσμού. Σκοπός αυτών των συζευγμάτων είναι η δέσμευση του πεπτιδικού αναλόγου στον υποδοχέα της GnRH και η απελευθέρωση του αναλόγου της μιτοξανδρόνης μετά την αναγωγή του δισουλφιδικού δεσμού με τη βοήθεια του συστήματος της θειορεδοξίνης.Πραγματοποιήθηκε διαμορφωτική μελέτη με τη χρήση τεχνικών Μοριακής Μοντελοποίησης των αγωνιστικών πεπτιδικών ανάλογων της GnRH και των αντίστοιχων συζευγμάτων τους. Επιπλέον, όλα τα ανάλογα μελετήθηκαν μέσω 1D και 2D Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR). Οι μελέτες παρείχαν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη διαμόρφωση των αναλόγων. Το πιο υποσχόμενο σύζευγμα μελετήθηκε για την ικανότητα αναγωγής του δισουλφιδικού δεσμού από το σύστημα της θειορεδοξίνης και τη σταθερότητά του κατά τη διάρκεια μακροπρόθεσμης αποθήκευσης σε διαφορετικές μορφές (υγρό/ στερεό) και θερμοκρασίες.