Posttranscriptional regulation of the components of the human leukocyte antigen class I antigen processing and presentation machinery as an immune escape mechanism in melanoma

Abstract

Tumours are characterised by an aberrant cell proliferation rate along with the potential to invade or spread to other parts of the body. Melanoma is acknowledged as one of the most immunogenic types of human tumours. “Avoiding immune destruction” is a key hallmark of cancer cells which can be accomplished via several immune escape mechanisms limiting their recognition and destruction by either CD8+ T- or NK cells. Such tumour-mediated escape mechanisms can be associated with structural alterations, epigenetic modulations, loss of heterozygosity as well as posttranscriptional or posttranslational regulation mechanisms of genes associated with the HLA-I APM thereby limiting the HLA-I surface expression levels. In regard to the HLA-I APM, in particular the TAP subunits TAP1 and TAP2 along with the chaperone TPN are functionally critical components for the binding of peptide fragments, since TAP stabilizes the HC/β2-m heterodimers and TPN facilitates the peptide loading onto empty HLA-I molecules. However, in addition to the presentation of such antigenic peptide ligands in combination with classical HLA-I molecules to CD8+ T-cells, presentation of non-classical HLA-I molecules mediating inhibitory stimuli to NK cells can be involved in limiting cellular immune responses. In the context of the current thesis, the aspects of posttranscriptional regulations of HLA-I APM components by miRs and RBPs were analysed in more detail, since a heterogeneous and discordant mRNA and protein expression pattern of several HLA-I APM components, including TAP1, TAP2, TPN next to the HLA-I surface expression rate has been frequently described in tumours of distinct origin, including several in-house extensively characterized human melanoma cell lines. Thus, it was of great interest to define miRs and RBPs which can affect the expression of such immune regulatory molecules in tumour and immune cells, thereby leading to the escape of tumour cells from the immune surveillance or at least lowering their immune response capacity. Based on the successful identification of novel miRs and RPBs by performing high throughput analyses in combination with the miTRAP and RNA-AP assays, respectively the focus was set on defining posttranscriptional regulators of TAP1, TAP2 or TPN, targeting the respective 3’-UTRs. Moreover, the specific binding of the candidate miRs miR-200a-5p, miR-26b-5p and miR-21-3p to the TAP1 3’-UTR have been successfully confirmed via dual luciferase reporter assays. In addition, the expression rates of selected candidate miRs were not only correlated with the corresponding protein expression rates in a panel of model cell lines but also in a series of primary melanoma lesions along with their associations with relevant clinical parameters. Furthermore, their impact in regard to the susceptibility to undergo lysis be either CD8+ T- or NK cells were assessed. The presented data show that miR-mediated modulations of APM components can be associated with altered immune recognition pattern thereby having an impact on overall survival rates of melanoma patients. Thus, miR-200a-5p, miR-26-5p and miR-21-3p, together with miR-9-5p might be worth to be considered as potential future candidate biomarkers or eventually even could be further developed towards novel therapeutic targets for melanoma patients. Aside from these miR targets also a set of candidate RBPs was successfully identified which bind to either the 3’-UTRs of TAP1 or TPN, respectively. Amongst them, the roles of the candidate RBPs IGF2BP1 and IGF2BP3 have been characterized in more detail. Next to their impact on the modulation of the expression rates of the targeted APM components and on overall HLA-I surface expression levels. For IGF2BP transfectants comparative proteomic profilings versus respective controls resulted even in the successful identification of differentially expressed proteins which could further linked to functional networks, thereby implying that the dysregulation of these RBPs might be worthy to be addressed in further studies. Taken together, by the identification of these novel immune modulatory miRs and RBPs targeting TAP1, TAP2 or TPN, this study underlines the importance of the initially proposed posttranscriptional control mechanisms for HLA-I APM components and their likely role in contributing at least to some extent to the frequently observed immune escape promoting tumour growth. These molecules might thus be used as novel predictive markers or even as targets for future combinatorial cancer immunotherapy approaches.

Οι όγκοι χαρακτηρίζονται από ανώμαλο ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού μαζί με τη δυνατότητα να εισβάλουν ή να εξαπλωθούν σε άλλα μέρη του σώματος. Το μελάνωμα αναγνωρίζεται ως ένας από τους πιο ανοσογονικούς τύπους ανθρώπινων όγκων. Η «αποφυγή της ανοσολογικής καταστροφής» είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων που μπορεί να επιτευχθεί μέσω διαφόρων μηχανισμών διαφυγής του ανοσοποιητικού συστήματος, οι οποίοι περιορίζουν την αναγνώριση και την καταστροφή τους είτε από CD8+ T-κύτταρα είτε από κύτταρα φυσικούς φονείς (NK). Τέτοιοι μηχανισμοί διαφυγής με τη μεσολάβηση όγκου μπορούν να συσχετιστούν με χρωμοσωμικές αλλοιώσεις, επιγενετικές τροποποιήσεις, απώλεια ετεροζυγωτίας καθώς και μεταμεταγραφικούς ή μεταμεταφραστικούς μηχανισμούς ρύθμισης γονιδίων που σχετίζονται με το HLA τάξης Ι μηχανισμό επεξεργασίας και παρουσίασης αντιγόνων (HLA-I APM) περιορίζοντας έτσι τα επίπεδα έκφρασης των HLA-I στην επιφάνεια των κυττάρων. Όσο αφορά το HLA-I APM, οι μεταφορείς συνδεδεμένοι με την επεξεργασία του αντιγόνου (transporter associated with antigen processing, TAP) TAP1 και TAP2, μαζί με τη συνοδό ταπασίνη (TPN) είναι λειτουργικά σημαντικά συστατικά για τη σύνδεση των πεπτιδικών θραυσμάτων, αφού το TAP σταθεροποιεί τα ετεροδιμερή βαριάς αλυσίδας/β2-μικροσφαιρίνης (HC/β2-m) και η TPN διευκολύνει τη φόρτωση πεπτιδίων σε άδεια μόρια HLA-I. Όμως, εκτός από την παρουσίαση τέτοιων αντιγονικών πεπτιδικών συνδετών σε συνδυασμό με κλασικά μόρια HLA-I σε CD8+ Τ-κύτταρα, η παρουσίαση μη κλασικών μορίων HLA-I, που μεσολαβούν σε ανασταλτικά ερεθίσματα σε ΝΚ κύτταρα, μπορεί να εμπλέκεται στον περιορισμό των κυτταρικών ανοσοαποκρίσεων. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, οι πτυχές των μεταμεταγραφικών ρυθμίσεων των συστατικών του HLA-I APM από microRNAs (miRs) και RNA-binding proteins (RBPs) αναλύθηκαν λεπτομερέστερα, καθώς ένα ετερογενές μοτίβο έκφρασης, σε επίπεδο αγγελειαφόρου RNA (mRNA) και πρωτεϊνών, πολλών συστατικών του HLA-I APM, συμπεριλαμβανομένου των TAP1, TAP2, TPN καθώς και της έκφρασης των HLA-I στην επιφάνεια των κυττάρων έχει συχνά περιγραφεί σε όγκους διαφορετικής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων αρκετών εργαστηριακά εκτενώς χαρακτηρισμένων κυτταρικών σειρών ανθρώπινου μελανώματος. Είχε μεγάλο ενδιαφέρον να διερευνηθούν miRs και RBPs που μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση τέτοιων ανοσορυθμιστικών μορίων τόσο σε καρκινικά κύτταρα όσο και ανοσοκύτταρα, οδηγώντας έτσι στη διαφυγή των καρκινικών κυττάρων από την ανοσολογική επιτήρηση ή τουλάχιστον στη μείωση της ικανότητας ανοσοαπόκρισής. Με βάση την επιτυχή ανίχνευση νέων miRs και RPBs με αναλύσεις υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με τις αναλύσεις miTRAP και RNA-AP, αντίστοιχα, δόθηκε έμφαση στον καθορισμό μεταμεταγραφικών ρυθμιστών των TAP1, TAP2 ή TPN, στοχεύοντας τις αντίστοιχες 3' αμετάφραστες περιοχές (3'-UTR). Ακόμα, η ειδική σύνδεση των υποψηφίων miRs: miR-200a-5p, miR-26b-5p και miR-21-3p στην TAP1 3’-UTR έχει επιβεβαιωθεί επιτυχώς μέσω αντιδράσεων λουσιφεράσης. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης των επιλεγμένων υποψήφιων miRs δεν συσχετίστηκαν μόνο με τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές αλλά και σε μια σειρά από δείγματα ανθρώπινων πρωτογενών βλαβών μελανώματος μαζί με τις συσχετίσεις τους με σχετικές κλινικές παραμέτρους. Αξιολογήθηκε επίσης η επίδρασή τους αναφορικά με την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να υποστούν λύση είτε από CD8+ Τ- κύτταρα είτε από ΝΚ κύτταρα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται δείχνουν ότι οι τροποποιήσεις των συστατικών APM από miRs μπορούν να συσχετιστούν με αλλοιωμένη ανοσολογική αναγνώριση, επηρεάζοντας έτσι τα επίπεδα της συνολικής επιβίωσης ασθενών με μελάνωμα. Έτσι, τα miR-200a-5p, miR-26-5p και miR-21-3p, μαζί με το miR-9-5p, θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως πιθανοί μελλοντικοί υποψήφιοι βιοδείκτες ή τελικά να αναπτυχθούν περαιτέρω ως νέοι θεραπευτικοί στόχοι για ασθενείς με μελάνωμα. Εκτός από τα προαναφερθέντα miRs, εντοπίστηκε επιτυχώς ένα σύνολο υποψήφιων RBPs που συνδέονται στις 3'-UTRs είτε του TAP1 είτε με το TPN. Αναμεσά τους, οι ρόλοι των υποψηφίων RBPs IGF2BP1 και IGF2BP3 έχουν χαρακτηριστεί λεπτομερέστερα, καθώς και στον αντίκτυπό τους στη διαμόρφωση των επιπέδων έκφρασης των στοχευόμενων συστατικών του APM και στα συνολικά επίπεδα έκφρασης των HLA-I στην επιφάνεια των κυττάρων. Για τα διαμολυσμένα κύτταρα με IGF2BP, η σύγκριση των πρωτεομικών προφίλ με τους αντίστοιχους μάρτυρες (controls) οδήγησαν ακόμη και στην επιτυχή ταυτοποίηση πρωτεϊνών που εκφράζονταν σε διαφορετικά επίπεδα και θα μπορούσαν να συνδεθούν περαιτέρω με λειτουργικά δίκτυα, υπονοώντας έτσι ότι η απορρύθμιση αυτών των RBPs μπορεί να αξίζει να μελετηθεί περαιτέρω. Εν κατακλείδι, με την ανίχνευση αυτών των νέων ανοσοτροποποιητικών miRs και RBPs που στοχεύουν τα TAP1, TAP2 ή TPN, αυτή η μελέτη υπογραμμίζει τη σημασία των αρχικά προτεινόμενων μηχανισμών μεταμεταγραφικού ελέγχου για τα συστατικά του HLA-I APM και την πιθανή συμβολή τους τουλάχιστον σε κάποιο βαθμό στη συχνά παρατηρούμενη ανοσολογική διαφυγή που προάγει την ανάπτυξη των όγκων. Αυτά τα μόρια θα μπορούσαν έτσι να χρησιμοποιηθούν ως νέοι προγνωστικοί δείκτες ή ακόμη και ως στόχοι για μελλοντικές συνδυαστικές ανοσοθεραπείες καρκίνου.

Tumore zeichnen sich durch eine aberrante Zellproliferationsrate sowie die Fähigkeit aus, in andere Körperteile einzudringen oder sich auszubreiten. Das Melanom gilt als einer der immunogensten Tumore. Die Vermeidung der Zerstörung durch Immunzellen ist ein Schlüsselmerkmal von Krebszellen, das über mehrere immune escape Mechanismen erreicht werden kann, die ihre Erkennung und Zerstörung durch CD8+ T- oder NK-Zellen einschränken. Solche tumorvermittelten Fluchtmechanismen können mit strukturellen Veränderungen, epigenetischen Modulationen, Verlust der Heterozygotie sowie posttranskriptionellen oder posttranslationalen Regulationsmechanismen assoziiert sein, die mit dem HLA-I-APM assoziiert sind, wodurch die HLA-I-Oberflächenexpressionsniveaus begrenzt werden. In Bezug auf das HLA-I-APM sind insbesondere die TAP-Untereinheiten TAP1 und TAP2 zusammen mit dem Chaperon TPN funktionell kritische Komponenten für die Bindung von Peptidfragmenten, da TAP die HC/β2-m-Heterodimere stabilisiert und TPN die Peptidbeladung auf leere HLA-I-Moleküle erleichtert. Zusätzlich zur Präsentation solcher antigener Peptidliganden in Kombination mit klassischen HLA-I-Molekülen gegenüber CD8+ -T-Zellen kann die Präsentation nicht klassischer HLA-I-Moleküle, die inhibitorische Stimuli gegenüber NK-Zellen vermitteln, an der Begrenzung der zellulären Immunantworten beteiligt sein. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Aspekte der posttranskriptionellen Regulation von HLA-I-APM-Komponenten durch miRs und RBPs analysiert, da ein heterogenes und nicht übereinstimmendes mRNA- und Proteinexpressionsmuster bei mehreren HLA-I-APM-Komponenten, einschließlich der TAP1-, TAP2-, TPN- und HLA-I-Oberflächenexpressionsrate häufig bei Tumoren beschrieben wurde. Daher war es von großem Interesse, miRs und RBPs zu definieren, die die Expression solcher Immunregulationsmoleküle in Tumor- und Immunzellen beeinflussen können, wodurch Tumorzellen aus der Immunüberwachung entkommen oder ihre Immunantwortkapazität verringern. Basierend auf der erfolgreichen Identifizierung neuartiger miRs und RPBs durch die Durchführung von Hochdurchsatzanalysen in Kombination mit den miTRAP- und RNA-AP-Assays wurde der Schwerpunkt auf die Definition posttranskriptionaler Regulatoren von TAP1, TAP2 oder TPN gelegt, die auf die jeweiligen 3'-UTRs abzielen. Darüber hinaus wurde die spezifische Bindung der Kandidaten-miRs miR-200a-5p, miR-26b-5p und miR-21-3p an die TAP1 3'-UTR erfolgreich über Dual-Luciferase-Reporter-Assays bestätigt. Darüber hinaus korrelierten die Expressionsraten ausgewählter miRs-Kandidaten nicht nur mit den entsprechenden Proteinexpressionsraten in einer Vielzahl von Modellzelllinien, sondern auch in einer Reihe von primären Melanomläsionen sowie deren Assoziation mit relevanten klinischen Parametern. Darüber hinaus wurde ihre Auswirkung auf die Anfälligkeit für eine Lyse von entweder CD8+ T- oder NK-Zellen bewertet. Die präsentierten Daten zeigen, dass miR-vermittelte Modulationen von APM-Komponenten mit einem veränderten Immunerkennungsmuster assoziiert sein können, wodurch sich dies auf die Gesamtüberlebensrate von Melanompatienten auswirkt. Daher könnten miR-200a-5p, miR-26-5p und miR-21-3p zusammen mit miR-9-5p als potenzielle zukünftige Kandidaten für Biomarker in Betracht gezogen oder möglicherweise sogar in Richtung neuartiger therapeutischer Ziele für Melanompatienten weiterentwickelt werden. Abgesehen von diesen miR-Zielstrukturen wurden auch eine Reihe von Kandidaten-RBPs erfolgreich identifiziert, die an die 3'-UTRs von TAP1 bzw. TPN binden. Unter diesen wurde die Rolle der Kandidaten-RBPs IGF2BP1 und IGF2BP3 detaillierter charakterisiert. Neben ihrem Einfluss auf die Modulation der Expressionsraten der Ziel-APM-Komponenten veränderten sie ebenfalls das HLA-I-Oberflächenexpressionsniveau. Für IGF2BP-Transfektanten führten vergleichende proteomische Profilierungen gegenüber den jeweiligen Kontrollen sogar zur erfolgreichen Identifizierung differentiell exprimierter Proteine, die weiter mit funktionellen Netzwerken verknüpft sein könnten, was impliziert, dass die Deregulation dieser RBPs in weiteren Studien behandelt werden könnte. Zusammengenommen unterstreicht diese Studie durch die Identifizierung dieser neuartigen immunmodulierenden miRs und RBPs, die auf TAP1, TAP2 oder TPN abzielen, die Bedeutung der ursprünglich vorgeschlagenen posttranskriptionellen Kontrollmechanismen für HLA-I-APM-Komponenten und ihre wahrscheinliche Rolle, zumindest teilweise für die häufig beobachtete Immunflucht beizutragen, die das Tumorwachstum fördert. Diese Moleküle könnten daher als neuartige prädiktive Marker oder sogar als Ziele für zukünftige kombinatorische Krebsimmuntherapieansätze verwendet werden.