Development and validation of molecular assays for gene expression and DNA mutations in liquid biopsy samples

Abstract

Molecular analysis in liquid biopsy samples requires the development of methodologies with high specificity and sensitivity in order to overcome the limitations and challenges. Here, in this PhD thesis, new methodologies with highly sensitive technologies were developed and validated in liquid biopsy samples. 1) We evaluated the performance of a novel multiplex assay for the detection of ten ESR1 mutations and AKT1 E17K in plasma-cell free DNA (cfDNA) based on Crystal Digital PCR®. Towards this, we analyzed in parallel identical plasma-cfDNA samples for ESR1 mutations with the multiplex Crystal Digital PCR® assay and the ESR1-NAPA assay and compared directly the results. 2) We investigated whether analysis of ESR1 mutations in circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor DNA (ctDNA) provide complementary information on resistance to endocrine therapy. Using a highly sensitive multiplex ddPCR assay, we detected a higher percentage of mutations in CTC-derived genomic (gDNAs) than in paired ctDNA in patients with metastatic breast cancer. 3) We conducted a study to directly compare our ultrasensitive real-time PCR assay based on the combination of ARMS-PCR for the detection of PIK3CA p.E545K, p.E542K, p.H1047R mutations with ddPCR in primary tumors and plasma-cfDNA, and directly compare the PIK3CA mutational status in CTC-derived gDNAs and paired plasma-cfDNA samples. 4) A new method was evaluated that uses ultraviolet light to eliminate wild-type (wt-DNA) alleles and enables improved detection of minor genetic or epigenetic changes. PD-UVME employed oligonucleotide probes that incorporated a photosensitive 3-cyanovinylcarbazole nucleoside (CNVK), placed directly opposite interrogated pyrimidines, such as thymine or cytosine in wt-DNA. PD-UVME was combined with ddPCR to detect BRAF V600E mutation in model systems, thyroid patient cancer tissue samples, and ctDNA from melanoma patients. 5) We conducted a study to develop and validate a novel RT-qPCR assay for CTLA-4 transcripts and study the expression of CTLA-4 in CTCs of patients with metastatic cancer under immunotherapy.

Η μοριακή ανάλυση σε δείγματα υγρής βιοψίας απαιτεί την ανάπτυξη μεθοδολογιών με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία προκειμένου να ξεπεραστούν οι περιορισμοί και οι προκλήσεις. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αναπτύχθηκαν νέες μεθοδολογίες με εξαιρετικά ευαίσθητες τεχνολογίες και επικυρώθηκαν σε δείγματα υγρής βιοψίας. 1) Αξιολογήθηκε η απόδοση μιας τεχνολογίας για την ανίχνευση πολλαπλών μεταλλάξεων ESR1 και της AKT1 E17K σε ελεύθερο κυκλοφορούν DNA (cfDNA) με βάση την Crystal Digital PCR®. Προς αυτή την κατεύθυνση, αναλύθηκαν παράλληλα πανομοιότυπα δείγματα πλάσματος για τις μεταλλάξεις ESR1 με την Crystal Digital PCR® και το πρωτόκολλο ESR1-NAPA και συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα. 2) Διερευνήθηκε εάν η ανάλυση των μεταλλάξεων ESR1 σε κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTCs) και κυκλοφορούν καρκινικό DNA (ctDNA) παρέχει συμπληρωματικές πληροφορίες σχετικά με την αντοχή στην ενδοκρινική θεραπεία. Χρησιμοποιώντας την ddPCR, εντοπίσαμε υψηλότερο ποσοστό μεταλλάξεων σε γενωμικό DNA (gDNA) που προέρχεται από τα CTC από ό,τι στο ctDNA σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο μαστού. 3) Πραγματοποιήθηκε μια μελέτη για να συγκρίνουμε την υπερευαίσθητη PCR σε πραγματικό χρόνο με συνδυασμό ειδικών εκκινητών, ασύμμετρης PCR (ARMS-PCR) για την ανίχνευση των PIK3CA p.E545K, p.E542K, p.H1047R μεταλλάξεων με ddPCR σε πρώιμους όγκους και cfDNA και συγκρίναμε τις δύο τεχνικές. 4) Αξιολογήθηκε μια νέα μέθοδος (PD-UVME) που χρησιμοποιεί το υπεριώδες φως για την εξάλειψη των αλληλόμορφων wt-DNA και επιτρέπει τη βελτιωμένη ανίχνευση γενετικών ή επιγενετικών αλλαγών. Το PD-UVME χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ενσωματωμένους με ένα φωτοευαίσθητο νουκλεοτίδιο 3-κυανοβινυλοκαρβαζόλης (CNVK), τοποθετημένο ακριβώς απέναντι από τις επιθυμητές πυριμιδίνες, όπως θυμίνη ή κυτοσίνη στο wt-DNA. Το PD-UVME συνδυάστηκε με ddPCR για την ανίχνευση μεταλλάξεων BRAF V600E σε συστήματα μοντέλων, δείγματα ιστού ασθενών με καρκίνο του θυρεοειδούς και ctDNA από ασθενείς με μελάνωμα. 5) Πραγματοποιήθηκε μια μελέτη για την ανάπτυξη και την επικύρωση μιας νέας μεθόδου RT-qPCR για ανίχνευση μεταγράφων CTLA-4 και μελετήθηκε η έκφραση του CTLA-4 σε CTCs ασθενών με μεταστατικό καρκίνο πνεύμονα, κεφαλής και τραχήλου και μελανώματος υπό ανοσοθεραπεία.