Structural and functonal analysis of membrane protein complexes from the photosynthetic bacterium Chlorobaculum tepidum

Abstract

Chlorobaculum tepidum (Cba tepidum) is a green sulfur phototroph bacterium that predominantly oxidizes reduced sulfur compounds for photoautotrophic growth. Cba tepidum, can oxidize sulfide and thiosulfate to produce extracellular S0 globules, which can be further oxidized to sulfate and used as electron donors for phototrophic growth. To gain insight into its sulfur metabolism, label-free quantitative proteomics was utilized. The sampling consisted of cell lysates from different metabolic states, including a sulfur production state (10 h post-incubation), the beginning of sulfur consumption (20 h), and the end of sulfur consumption (40 h), respectively. The results showed that Cba tepidum regulates enzymes involved in sulfur metabolism in response to the availability of reduced sulfur compounds and a model showing the protein expression is presented in this study. The biosynthesis of polyphosphate (polyP) granule is important for survival for bacteria during resistance to diverse environmental stresses but the biogenesis of the polyP granule is poorly understood. In Cba tepidum the presence of electron rich granules was reported, but no further information was provided. Based on the label free proteomic data it was possible to track down the differential expression of the polyP related enzymes. Finally, the structural characterization and the final proof of the existence of the polyphosphate polymer and the total phosphate content in the cells was achieved by P31 NMR and absorption spectroscopy respectively. Phototrophic organism converts light energy from the sun into chemical energy, thereby sustaining most life forms on Earth. Light energy is captured by antenna systems and is subsequently transferred to the reaction center (RC) to initiate a series of charge-separation and electron-transfer reactions to the terminal electron acceptors. Chlorosomes, the light-harvesting apparatus of green bacteria, are unique antenna systems in which pigments are organized in aggregates rather than associated with proteins. They are flattened ellipsoidal structures and are attached to the inner surface of the cytoplasmic membrane via their “baseplate” regions. This localization ensures that the light-harvesting antennae are in close proximity to the reaction centers embedded in the cytoplasmic membrane. The importance of the vitamin B12 has been proven for many strains of this family and it is considered a vital growth factor. Cba tepidum needed the vitamin as a cofactor mainly for the biosynthesis of photosynthetic pigments. Interestingly, major differences were observed regarding the methanolic extract from the cell that were cultivated with and without B12. The size of the isolated chlorosome is calculated using negative staining and DLS, while the thin section of the whole cells also indicated the difference in size of the chlorosomes between cultures contain vitamin B12 and B12 depleted cultures. Finally based on label free proteomics as well as metabolomics NMR it was possible to construct a model showing the effect of B12 depletion in proteomic and metabolomic level.Based on the terminal electron acceptor, which is an iron sulfur cluster, Cba tepidum has a Type I RC. The membrane-embedded RC of Cba tepidum is associated with a soluble energy transmitter the Fenna-Matthews-Olson protein (FMO). All RCs are evolved from homodimeric RC similar to those seen in green sulfur bacteria (GSB) and heliobacteria and the structural analysis of the RC of Cba tepidum will give insights into the evolution of photosystems. The structure of the intact FMO-RC apparatus from Cba tepidum was resolved at 2.5 Å resolution by Cryo-EM Single Particle Analysis. The structure of this photosynthetic RC complex, which exhibits features of both type I and II RCs, fills an important gap in our understanding of the photosynthetic complex function and provides a basis for a more comprehensive examination of its energy and electron transfer functions through both experimental and theoretical approaches. Based on molecular dynamic simulations (MD), which, combined with bioinformatic tools, provided structural and dynamic insight into the complex between the membrane subunits of the RC. More specifically, the microscopic dynamic model involved extensive sampling at atomic resolution and at a cumulative time-scale of 22µs and revealed well-defined protein-protein interactions (PPI). These results provided information regarding the electron transport to the homodimeric core of GBS.

To Chlorobaculum tepidum (Cba tepidum) είναι ένα πράσινο θειούχο βακτήριο που χρησιμοποιεί σαν ηλεκτρονιοδότες θειούχα και θειοθιικά άλατα. Αυτά τα οξειδώνει και δημιουργεί εξωκυττάρια σφαιρίδια στοιχειακού θείου τα οποία χρησιμοποιούνται και αυτά σαν ηλεκτρονιοδότες. Για να αποκτήσουμε μια εικόνα του μεταβολισμού του θείου του, πραγματοποιήθηκε Label Free πρωτεωμική ανάλυση. Η δειγματοληψία περιελάβανε κυτταρόλυμα από διαφορετικές ώρες καλλιέργειας, συμπεριλαμβανομένης της αρχής παραγωγής θείου (10 ώρες μετά την επώαση), την έναρξη της μέγιστης παραγωγής θείου (20 ώρες) και το τέλος της κατανάλωσης θείου (40 ώρες), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Cba tepidum εκφράζει τα ένζυμα που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του θείου ως απόκριση στη διαθεσιμότητα ανηγμένων ενώσεων θείου και ένα μοντέλο που δείχνει την έκφραση πρωτεΐνης παρουσιάζεται σε αυτή τη μελέτη. Η βιοσύνθεση των σφαιριδίων πολυφωσφορικού (polyP) είναι σημαντική για την επιβίωση των βακτηρίων κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε διάφορες περιβαλλοντικές πιέσεις, αλλά η βιογένεση του polyP δεν είναι μελετημένη. Στο Cba tepidum αναφέρθηκε η παρουσία συσψματομάτων πλούσιων σε ηλεκτρόνια, αλλά δεν είχαν χαρακτηριστεί. Με βάση τα πρωτεομικά δεδομένα, ήταν δυνατό να εντοπιστεί η διαφορική έκφραση των ενζύμων που σχετίζονται με το polyP. Τέλος, ο δομικός χαρακτηρισμός και η τελική απόδειξη της ύπαρξης του πολυφωσφορικού πολυμερούς και της συνολικής περιεκτικότητας σε φωσφορικά στα κύτταρα επιτεύχθηκε με P31 NMR και φασματοσκοπία απορρόφησης αντίστοιχα.Οι φωτότρωφοι οργανισμοί μετατρέπουν την φωτεινή ενέργεια από τον ήλιο σε χημική ενέργεια, συντηρώντας έτσι τις περισσότερες μορφές ζωής στη Γη. Η φωτεινή ενέργεια συλλέγεται από τις κεραίες και στη συνέχεια μεταφέρεται στα κέντρα αντίδρασης (RC) για να ξεκινήσει μια σειρά αντιδράσεων διαχωρισμού φορτίου και μεταφοράς ηλεκτρονίων προς τους τερματικούς δέκτες ηλεκτρονίων. Τα χλωροσώματα, η κεραία συλλογής φωτός των πράσινων βακτηρίων, είναι μοναδικά συστήματα στα οποία οι χρωστικές είναι οργανωμένες σε συσσωματώματα αντί να συνδέονται με πρωτεΐνες. Πρόκειται για πεπλατυσμένες ελλειψοειδείς δομές και συνδέονται με την εσωτερική επιφάνεια της κυτταροπλασματικής μεμβράνης μέσω των περιοχών της «βάσης» τους. Αυτή η δομή διασφαλίζει ότι οι κεραίες συλλογής φωτός βρίσκονται σε άμεση επαφή με τα κέντρα αντίδρασης που είναι ενσωματωμένα στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Η σημασία της βιταμίνης Β12 έχει αποδειχθεί για πολλά στελέχη αυτής της οικογένειας και θεωρείται ζωτικός παράγοντας ανάπτυξης. Το Cba tepidum χρειάζεται τη βιταμίνη ως συμπαράγοντα κυρίως για τη βιοσύνθεση φωτοσυνθετικών χρωστικών. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές από το μεθανολικό εκχύλισμα από το κύτταρο που καλλιεργήθηκε με και χωρίς Β12. Το μέγεθος του απομονωθέντος χλωροσώματος υπολογίζεται χρησιμοποιώντας αρνητική χρώση και DLS, ενώ η λεπτή τομή των ολόκληρων κυττάρων έδειξε επίσης τη διαφορά στο μέγεθος των χλωροσωμάτων που απομονώθηκαν από καλλιέργειες με και χωρίς την βιταμίνη. Τέλος, με βάση την πρωτεομική ανάλυση καθώς και τη μεταβολομική ανάλυση με NMR Η1, ήταν δυνατό να κατασκευαστεί ένα μοντέλο που δείχνει την επίδραση της στέρησης της Β12 σε πρωτεομικό και μεταβολομικό επίπεδο. Με βάση τον τερματικό δέκτη ηλεκτρονίων, που είναι ένα κέντρο σιδήρου θείου, το Cba tepidum έχει RC Τύπου Ι. Το ενσωματωμένο στη μεμβράνη RC του Cba tepidum συνδεετε με έναν διαλυτό πομπό ενέργειας την πρωτεΐνη Fenna-Matthews-Olson (FMO). Όλα τα RC προέρχονται από ομοδιμερή RC παρόμοια με αυτά που παρατηρούνται στα βακτήρια πράσινου θείου (GSB) και στα ηλιοβακτήρια. Η δομική ανάλυση του RC του Cba tepidum θα δώσει πληροφορίες για την εξέλιξη των φωτοσυστημάτων. Η δομή ολόκληρου του συμπλόκου FMO-RC από το Cba tepidum αναλύθηκε σε ευκρίνεια 2,5 Α με Single Particle Analysis Cryo-EM. Η δομή αυτού του συμπλόκου, το οποίο παρουσιάζει χαρακτηριστικά και των δύο RC τύπου Ι και ΙΙ, καλύπτει ένα σημαντικό κενό στην κατανόησή μας για τη λειτουργία του φωτοσυνθετικών οργανισμών και παρέχει τη βάση για μια πιο ολοκληρωμένη εξέταση των διεργασιών μεταφοράς ενέργειας και ηλεκτρονίων μέσω πειραματικών και θεωρητικών προσεγγίσεων.Οι μοριακές δυναμικές προσομοιώσεις (MD), σε συνδυασμό με βιοπληροφορικά εργαλεία, παρείχαν την δομική και δυναμική πληροφορία σχετικά με το σύμλοκο των υπομονάδων μεμβράνης του RC. Πιο συγκεκριμένα, το δυναμικό μοντέλο περιελάβανε εκτεταμένη δειγματοληψία σε ατομική ανάλυση και σε αθροιστική χρονική κλίμακα 22 μs και αποκάλυψε τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) μεταξύ των υπομονάδων ενδιαφέροντος. Αυτά τα αποτελέσματα παρείχαν πληροφορίες σχετικά με τη μεταφορά ηλεκτρονίων στην ομοδιμερή πυρήνα των GBS.