Molecular epidemiology and antimicrobial resistance spread of environmental Escherichia coli isolates: a One Health approach

Abstract

Antibiotic resistant bacteria are present in wastewaters as their elimination during treatment in wastewater treatment plants is often impossible. Water plays an important role in the spread of these microorganisms among humans, animals and the environment. Unfortunately, in Greece knowledge on prevalence and diversity of antibiotic resistance bacteria in environmental habitats is very limited. Therefore, this doctoral dissertation was designed to study antimicrobial resistance under the One Health approach and aimed to a) assess the antibiotic resistance patterns and detect the antibiotic resistance genes related to resistant phenotypes, b) identify molecular genotypes, c) compare resistance patterns and genotypes between clinical and environmental E. coli isolates and d) identify molecular mechanism contributing to antimicrobial resistance spread both in clinical settings and in environment (aquatic and wastewater). For this reason, during the thesis, a total of 139 clinical and 502 environmental E. coli isolates were collected. Environmental isolates were obtained from semi-treated hospital wastewater, treated wastewater, and river water samples. All these isolates (clinical and environmental) are spatially and temporally related. In order to examine the circulated phylogenies in the clinical settings and in different environmental habitats all isolates were subjected to the molecular typing technique of phylogrouping. This method shown that the phylogenetic group B2 was predominant in clinical settings (60%; 84/139) and the second most frequent among wastewaters, whereas group A was dominant in all environmental isolates (48%, 242/502). To determine the prevalent resistance patterns, all isolates (both clinical and environmental) were evaluated for their susceptibility to 18 commonly used antibiotics. Based on the results, the vast majority of both environmental and clinical isolates were resistant, particularly to penicillins. In addition, 84 isolates (73 environmental and 11 clinical) exhibiting resistant or multidrug-resistant profiles associated with β-lactamases were identified and analyzed for β-lactamase genes. The blaCTX-M-group 1 gene was found in 52 isolates (62%; 52/84), making it the most frequently encountered β-lactamase gene among both clinical and environmental isolates. Other β-lactamase genes detected included blaCTX-M-group 9 (8.4%; 7/84), blaTEM (14.3%; 12/84), blaSHV (20.2%; 17/84), blaOXA-244 (1.2%; 1/84), blaCMY-2 (2.4%; 2/84), blaDHA-1 (1.2%; 1/84), and blaFOX-17 (1.2%; 1/84). Finally, plasmid analysis, conjugation assay and plasmid sequencing were implemented in certain β- lactamase producing isolates to investigate the molecular environment of resistance genes and others molecular mechanisms which probable contributing to resistance dissemination. Out of the 33 isolates initially selected for the conjugation assay, only thirteen (39.4%; 13/33) appeared to contain conjugative plasmids and consequently the ability to transmit resistance το β-lactamases. Sequencing analysis was applied in three plasmids which were isolated from one clinical and two environmental E. coli and carried β-lactamase genes. Specifically, the three plasmids were ptrc203cli, ptrc618, and ptrc297, which respectively carried the β-lactamase genes blaDHA-1, blaCTX-M-14, and blaSHV-12. The first two plasmids belong to the compatibility group IncFII, while the last one belongs to the IncX3 group. Additionally, these conjugative plasmids not only carried the aforementioned β-lactamase genes but also additional resistance genes related to resistance to other categories of antibiotics. Specifically, ptrc203cli also co- carried resistance genes for sulfonamides (sul1), trimethoprim (drfA17), and fluoroquinolones (qnrB4); the plasmid ptrc618 harbored resistance genes for aminoglycosides (aac6’-Ib3), macrolides (mphA), and chloramphenicol (cmlA1); and ptrc297 carried a resistance gene for quinolones (qnrS1). The results also showed that all of the resistance genes were embedded within mobile elements (IS elements and integrons), which contribute to the further spread of multidrug resistance.In conclusion, this doctoral thesis reports confirming data that river water and wastewater serve as reservoirs of antibiotic resistant bacteria and as vehicles for the transmission of resistance genes to various bacterial species.

Ανθεκτικά και πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά βακτήρια συνεχώς εντοπίζονται στα λύματα, καθώς συχνά η επεξεργασία που υφίστανται τα λύματα κρίνεται ανεπαρκής στην εξάλειψη τέτοιων ανθεκτικών μικροοργανισμών. Το γεγονός αυτό και δεδομένου ότι τα επιβαρυμένα λύματα καταλήγουν σε υδάτινα σώματα ενώ ταυτόχρονα σε πολλές περιπτώσεις επαναχρησιμοποιούνται για βιομηχανικούς ή αρδευτικούς σκοπούς αποτελεί τεράστια απειλή για την υγεία του ανθρώπου και εν γένει του οικοσυστήματος. Δυστυχώς, στην Ελλάδα δεδομένα σχετικά με την αντιμικροβιακή αντοχή σε περιβαλλοντικά ενδιαιτήματα είναι πολύ περιορισμένα. Ως εκ τούτου, η παρούσα διδακτορική διατριβή σχεδιάστηκε για να μελετήσει την αντιμικροβιακή αντοχή, υιοθετώντας την προσέγγιση της Ενιαίας Υγείας (One Health), και είχε ως στόχο α) να αξιολογήσει τα πρότυπα αντοχής στα αντιβιοτικά και να ανιχνεύσει γονίδια που σχετίζονται με συγκεκριμένους ανθεκτικούς φαινοτύπους, β) να εντοπίσει τους διαφορετικούς γονότυπους που κυκλοφορούν στο εκάστοτε περιβάλλον, γ) να συγκρίνει τα πρότυπα αντοχής και τους γονότυπους που κυκλοφορούν στο υδάτινο περιβάλλον και στο λύμα με αυτούς που επικρατούν στο νοσοκομείο και δ) να εντοπίσει μοριακούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στην εξάπλωση της αντιμικροβιακής αντοχής τόσο στο ενδονοσοκομειακό περιβάλλον όσο και σε περιβαλλοντικά ενδιαιτήματα (ποτάμια και λύμα). Για το λόγο αυτό, κατά τη διάρκεια της διπλωματικής εργασίας, απομονώθηκαν συνολικά 139 κλινικά και 502 περιβαλλοντικά στελέχη Escherichia coli (E. coli). Τα περιβαλλοντικά στελέχη ανακτήθηκαν από μη-επεξεργασμένο νοσοκομειακό λύμα, από επεξεργασμένο λύμα και από δείγματα νερού ποταμών. Όλα αυτά τα στελέχη (κλινικά και περιβαλλοντικά) σχετίζονταν μεταξύ τους επιδημιολογικά (χωροχρονικά). Για την διερεύνηση των γονότυπων που κυκλοφορούν στο κλινικό περιβάλλον και στα διαφορετικά περιβαλλοντικά ενδιαιτήματα, όλα τα στελέχη υποβλήθηκαν στην τεχνική μοριακής τυποποίησης της Phylogrouping. Αυτή η μέθοδος έδειξε ότι η φυλογενετική ομάδα Β2 ήταν κυρίαρχη στα κλινικά στελέχη (60%, 84/139) και η δεύτερη πιο συχνή μεταξύ των στελεχών που είχαν απομονωθεί από λύματα, ενώ η ομάδα Α ήταν κυρίαρχη σε όλα τα περιβαλλοντικά στελέχη (48%, 242/502). Για τον προσδιορισμό των προτύπων αντοχής που κυκλοφορούν στο εκάστοτε περιβάλλον, όλα τα στελέχη (κλινικά και περιβαλλοντικά) αξιολογήθηκαν ως προς την ευαισθησία τους σε 18 ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιβιοτικά. Με βάση τα αποτελέσματα, η συντριπτική πλειοψηφία τόσο των περιβαλλοντικών όσο και των κλινικών στελεχών εμφάνισε αντοχή, και ιδίως στις πενικιλίνες. Επιπλέον, 84 στελέχη (73 περιβαλλοντικά και 11 κλινικά) που είχαν χαρακτηριστεί ως ανθεκτικά ή πολυανθεκτικά και είχαν φαινότυπο αντοχής που σχετίζεται με παραγωγή β-λακταμασών, υποβλήθηκαν σε μοριακό έλεγχο για την παρουσία γονιδίων β-λακταμασών. Το γονίδιο blaCTX-M-ομάδας 1 βρέθηκε σε 52 στελέχη (62%·52/84), καθιστώντας το το πιο συχνά εμφανιζόμενο γονίδιο β-λακταμάσης μεταξύ κλινικών και περιβαλλοντικών στελεχών. Άλλα γονίδια β-λακταμάσης που ανιχνεύθηκαν περιλάμβαναν blaCTX-M-ομάδα 9 (8,4%; 7/84), blaTEM (14,3%; 12/84), blaSHV (20,2%; 17/84), blaOXA-244 (1,2%; 1 /84), blaCMY-2 (2,4%; 2/84), blaDHA-1 (1,2%; 1/84) και blaFOX-17 (1,2%; 1/84). Τέλος, η πλασμιδιακή τυποποίηση, η δοκιμασία συζευκτικής ικανότητας και η πλασμιδιακή αλληλούχηση εφαρμόστηκαν σε ορισμένα στελέχη που παράγουν β-λακταμάσες αποσκοπώντας στη διερεύνηση του μοριακού υποβάθρου των γονιδίων αντοχής και άλλων μοριακών μηχανισμών που πιθανώς συμβάλλουν στη διασπορά της αντοχής. Από τα 33 στελέχη που επιλέχθηκαν αρχικά για την εκτίμηση της συζευκτικής ικανότητας, μόνο δεκατρία (39,4%· 13/33) φάνηκε πως διέθεταν συζευκτικά πλασμίδια και κατά συνέπεια την ικανότητα μετάδοσης αντοχής σε β-λακταμικά αντιβιοτικά. Σε τρία πλασμίδια, που είχαν απομονωθεί από ένα κλινικό και δύο περιβαλλοντικά στελέχη E. coli που έφεραν γονίδια β-λακταμασών, εφαρμόστηκε αλληλούχηση και ανάλυση. Συγκεκριμένα, τα τρία πλασμίδια ήταν τα ptrc203cli, ptrc618 και ptrc297, τα οποία έφεραν αντίστοιχα τα γονίδια β-λακταμασών blaDHA-1, blaCTX-M-14 και blaSHV-12. Τα δύο πρώτα πλασμίδια κατατάχθηκαν στην ομάδα συμβατότητας IncFII, ενώ το τελευταίο στην ομάδα IncX3. Επιπλέον, αυτά τα συζευκτικά πλασμίδια εκτός από τα προαναφερθέντα γονίδια β-λακταμάσης περιείχαν και επιπλέον γονίδια που προσδίδουν αντοχή σε άλλες κατηγορίες αντιβιοτικών. Συγκεκριμένα, το ptrc203cli μετέφερε ταυτόχρονα γονίδια αντοχής σε β-λακτάμες (blaDHA-1), σουλφοναμίδες (sul1), τριμεθοπρίμη (drfA17) και φθοριοκινολόνες (qnrB4), το πλασμίδιο ptrc618 περιείχε γονίδια αντοχής σε β-λακτάμες (blaCTX-M-14), αμινογλυκοσίδες (aac6'-Ib3), μακρολίδες (mphA) και χλωραμφενικόλη (cmlA1) ενώ το ptrc297 έφερε ένα γονίδιο αντοχής σε β-λακτάμες (blaSHV-12) και κινολόνες (qnrS1). Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι όλα τα γονίδια αντοχής ήταν ενσωματωμένα σε κινητές γενετικές μονάδες (στοιχεία IS και ιντεγκρόνια), οι οποίες συμβάλλουν στην περαιτέρω εξάπλωση της πολυανθεκτικότητας. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής επιβεβαιώνουν για άλλη μια φορά πως το νερό των ποταμών και τα λύματα χρησιμεύουν ως δεξαμενές βακτηρίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά και λειτουργούν ως όχημα για τη διασπορά της αντοχής μεταξύ των διαφορετικών βακτηριακών πληθυσμών.