Investigation of the molecular mechanisms underlying insecticide resistance in insects of medical importance

Abstract

Approximately 80% of world’s population lives at risk of one or more arthropod-borne diseases, thriving primarily in the tropics and sub-tropics around the globe. Malaria and leishmaniasis, transmitted by Anopheles mosquitoes and phlebotomine sand flies, respectively, are major parasitic-causative diseases responsible for more than half a million deaths in an annual basis. Insecticide-based vector control has been the cornerstone of these diseases’ mitigation efforts. However, the prolonged use of a small repertoire of mode of actions for both public health and agricultural purposes, has led to the development of insecticide resistance (IR), jeopardising to date’s vector control achievements. Unravelling the molecular basis of IR phenotypes (e.g. target-site resistance, metabolic detoxification, etc) is necessary to monitor and tackle the problem. In the present PhD thesis, I elaborated on: (I) monitoring IR in phlebotomine sand fly vectors’ population from regions poorly surveyed thus far, and attempting to generate tools for IR monitoring specifically in sand flies; and (II) biochemically and functionally characterising carboxyl-esterase COEAE6G, associated with IR in the major malaria vector Anopheles coluzzii.IR is significantly under-studied in sand fly vectors. Here, the response to pyrethroids was assessed using bioassays and/or molecular diagnostics in collections from (semi-)rural areas of Italy, Greece, Turkey, Iran and Kenya. Common pyrethroid target-site resistance markers, i.e. kdr mutations in the voltage-gated sodium channel gene, were detected extensively in Turkey, and for the first time in Greece and Iran, while no mutations were present in populations from Italy. Added to that, mixed species populations from Greece and Kenya, subjected to CDC bioassays, displayed susceptibility to deltamethrin, using though the mosquito discriminating conditions; certain difficulties in performing sand fly bioassays in the present time, and interpreting/comparing the generated results are extensively discussed in this chapter. Moreover, a novel individual bioassay protocol was developed, proposed to operate in regions with mixed species structure, and by using it, distinct responses to deltamethrin were exhibited by different sand fly species. Last but not least, I partially contributed to an effort to generate genomic resources for eleven phlebotomine sand fly species, aiming to gain insights into their adaptations to insecticides/xenobiotics, and extract potential insecticide resistance candidate genes. In Anopheles mosquitoes, high-throughput methodologies have greatly elevated our knowledge on the molecular mechanisms driving IR, so far. Here, a case of metabolic resistance to insecticides of several classes mediated by over-expression of COEAE6G, a putative mitochondrial esterase, of An. coluzzii is investigated. Coeae6g has been found up-regulated in organophosphate and carbamate resistant Anopheles populations in the region of Africa, and has been associated specifically with copy number variation-induced resistance to pirimiphos methyl, a very promising carbamate insecticide recently introduced in malaria control interventions. Our findings derived from in vitro and in vivo tools functionally validate these associations. Firstly, by expressing Coeae6g in the Sf9 insect cell line using the baculovirus system, it was shown that the enzyme’s activity is inhibited by organophosphate oxon analogs, including pirimiphos methyl oxon, for which the highest affinity was denoted, as well as carbamate compounds and the pyrethroid permethrin. Metabolism assays indicated though that COEAE6G is high likely to act via sequestration, and lack the ability to hydrolyse these insecticides. Furthermore, a transgenic An. gambiae line over-expressing constitutively Coeae6g under the control of GAL4/UAS system was created and displayed a multi-resistant phenotype against primarily pirimiphos methyl, followed by malathion, bendiocarb, propoxur and permethrin, in accordance with the in vitro data. It was lastly shown, that Coeae6g is endogenously expressed in multiple adult tissues, and that the enzyme is localised in the cytoplasm, and not in the mitochondria.

Κατά προσέγγιση, το 80% του παγκόσμιου πληθυσμού ζει υπό το ρίσκο μιας ή περισσότερων νόσων που μεταδίδονται από αρθρόποδα, οι οποίες παρουσιάζονται ενδημικές κυρίως στις τροπικές και υποτροπικές ζώνες. Η ελονοσία και η λεϊσμανίαση, που μεταδίδονται από τα κουνούπια του γένους Anopheles και τις σκνίπες, αντίστοιχα, αποτελούν τις σημαντικότερες παρασιτικές νόσους, υπεύθυνες για πάνω από μισό εκατομμύριο θανάτους ετησίως. Ο έλεγχος του εντόμου-φορέα με τη χρήση εντομοκτόνων έχει αποτελέσει θεμέλιο στην προσπάθεια εξάλειψης των ασθενειών αυτών, εδώ και αρκετές δεκαετίες. Παρόλα αυτά, η χρήση ενός περιορισμένου αριθμού εντομοκτόνων με μικρό εύρος στους τρόπους/ στόχους δράσης, με σκοπό την καταπολέμηση εντόμων υγειονομικής αλλά και αγροτικής σημασίας, έχει οδηγήσει την ανάπτυξη και εξάπλωση ανθεκτικότητας. Η διερεύνηση της μοριακής βάσης των ανθεκτικών αυτών φαινοτύπων (π.χ. ανθεκτικότητα στόχου, μεταβολική ανθεκτικότητα, κ.λπ.) είναι απαραίτητη για την επιτήρηση και επίλυση του προβλήματος. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, επικεντρώθηκα: (α) στην επιτήρηση της ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα σε πληθυσμούς σκνιπών από περιοχές που δεν έχουν ερευνηθεί έως τώρα, και στην ανάπτυξη ειδικών εργαλείων για τέτοιες διαδικασίες στις σκνίπες, και (β) στον βιοχημικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό της καρβοξυλεστεράσης COEAE6G, που έχει συσχετιστεί με ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα, στον κύριο φορέα ελονοσίας στην Αφρική, το κουνούπι Anopheles coluzzii. Η ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα είναι ιδιαίτερα υπο-μελετημένη στις σκνίπες. Εδώ, αξιολογήθηκε η ανταπόκριση στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα, με τη χρήση βιοδοκιμών και μοριακών διαγνωστικών, σε συλλογές σκνιπών από (ημι)αγροτικές περιοχές της Ιταλίας, της Ελλάδας, της Τουρκίας, του Ιράν και της Κένυας. Κοινοί δείκτες ανθεκτικότητας στόχου στα πυρεθροειδή, δηλαδή οι kdr μεταλλαγές στο γονίδιο που κωδικοποιεί για το κανάλι νατρίου, εντοπίστηκαν σε υψηλές συχνότητες στην Τουρκία, σε χαμηλότερες συχνότητες αλλά για πρώτη φορά στην Ελλάδα και το Ιράν, ενώ ήταν απούσες απ’ τους πληθυσμούς της Ιταλίας. Επιπρόσθετα, πληθυσμοί μεικτών ειδών από την Ελλάδα και την Κένυα έδειξαν ευαισθησία στο πυρεθροειδές δελταμεθρίνη, σε βιοδοκιμές τύπου CDC, χρησιμοποιώντας ωστόσο τις διαγνωστικές σταθερές των κουνουπιών. Περί αυτού, και των δυσκολιών που εμφανίζονται επί του παρόντος στην εφαρμογή, ερμηνεία και σύγκριση τέτοιων ευρημάτων βιοδοκιμών, γίνεται εκτενής συζήτηση και σχολιασμός. Επίσης, σχεδιάστηκε ένα νέο πρωτόκολλο βιοδικών για ατομική έκθεση δειγμάτων σκνιπών, το οποίο προτείνεται να εφασμοστεί σε περιοχές με μεικτή σύνθεση ειδών, προκειμένου να αποκαλύπτονται οι διαφορετικές αποκρίσεις τους στα εντομοκτόνα. Πράγματι, χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο πρωτόκολλο σε πληθυσμούς πεδίου, αποκαλύπτονται στατιστικά σημαντικές διαφορές απόκρισης μεταξύ ειδών του γένους Phlebotomus. Τέλος, συνέβαλα μερικώς στην παραγωγή πληροφοριών σχετικών με το γονιδίωμα 11 διαφορετικών ειδών σκνίπας, με σκοπό την κατανόηση της προσαρμογής τους σε εντομοκτόνα/ξενοβιοτικές ουσίες, και στην μελλοντική ταυτοποίηση υποψήφιων γονιδίων σχετιζόμενων με ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα. Όσον αφορά στα κουνούπια του γένους Anopheles, τεχνολογίες υψηλής απόδοσης έχουν συμβάλλει σημαντικά στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα, μέχρι στιγμής. Εδώ, ερευνάται μια περίπτωση μεταβολικής ανθεκτικότητας σε μια σειρά εντομοκτόνων διαφορετικών ομάδων, λόγω υπερέκφρασης του ενζύμου COEAE6G, μιας εστεράσης με προβλεπόμενο υπο-κυτταρικό εντοπισμό στα μιτοχόνδρια. Το γονίδιο Coeae6g έχει βρεθεί υπερεκφρασμένο σε Αφρικανικούς πληθυσμούς κουνουπιών Anopheles, ανθεκτικούς σε οργανοφωσφορικά και καρβαμιδικά εντομοκτόνα, και έχει επιπλέον συσχετιστεί με ανθεκτικότητα, λόγω αυξημένου αριθμού αντιγράφων γονιδίου, στο pirimiphos methyl, πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενο σε υπολειμματικούς ψεκασμούς για τον έλεγχο της ελονοσίας. Τα ευρήματα μας από προσεγγίσεις in vitro και in vivo επικυρώνουν τους συσχετισμούς με δεδομένα πεδίου. Αρχικά, έκφραση του γονιδίου Coeae6g στην κυτταρική σειρά Sf9 έδειξε, ότι η ενεργότητα του ενζύμου αναστέλλεται παρουσία ενεργών oxon αναλόγων οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων, συμπεριλαμβανομένου του pirimiphos methyl oxon, καθώς και καρβαμιδικών εντομοκτόνων και του πυρεθροειδούς περμεθρίνη. Aναλύσεις μεταβολισμού με τις μεθόδους HPLC-UV και HPLC-MS/MS υποδεικνύουν ωστόσο, ότι το ένζυμο δεν έχει δυνατότητα υδρόλυσης των παραπάνω εντομοκτόνων, άρα ως πιθανότερος τρόπος δράσης εμφανίζεται η «δέσμευση» εντομοκτόνου (sequestration) απ’ τον τελικό του στόχο. Επιπρόσθετα, δημιουργήθηκε μια διαγονιδιακή σειρά An. gambiae που να υπερ-εκφράζει συστηματικά, σε όλους τους ιστούς το γονίδιο Coeae6g, υπό τον έλεγχο του συστήματος GAL4/UAS, η οποία είχε ανθεκτικό φαινότυπο, κυρίως στο pirimiphos methyl, αλλά και στο malathion, το bendiocarb, το propoxur και την περμεθρίνη, σε συμφωνία με τα in vitro ευρήματά μας. Τέλος, το γονίδιο Coeae6g εκφράζεται ενδογενώς σε πολλαπλούς ιστούς του ενήλικου κουνουπιού, ενώ εξακριβώθηκε πως η πρωτεΐνη τοποθετείται υπο-κυτταρικά στο κυτταρόπλασμα, και όχι στα μιτοχόνδρια.