Μελέτη της βιολογικής δράσης φυσικών φαινολικών ενώσεων in vitro και in vivo

Abstract

Phenolic compounds are characterized as molecules of high added value and are found in abundance in many fruits and vegetables. They are widely known for their important biological activities and the beneficial effects they have on human health. Platelets play a central role in hemostasis and thrombus formation especially after endothelial injury. The aggregation and activation of platelets and the platelet-monocyte complex can under abnormal conditions of the body lead to cardiovascular diseases or atherothrombotic events. A series of flavonoids such as kaempferol, quercetin, catechin, epicatechin, myricetin, the three phenolic acids caffeic, ferulic and coumaric and the main phenolic compounds from pomegranate, wine mark, sea buckthorn, Goji berries were studied for their effect on the activation of platelets and mononuclear cells which is the main subject of the study. Based on the above, the antiplatelet effect of phenolic compounds in vitro experiments was initially studied. The measurements were carried out with two methods, the photometric method (aggregometry) and flow cytometry. In these experiments it appeared that all substances had an inhibitory effect on platelets and monocytes, with small differences in the results. Flow cytometry confirmed the platelet inhibition results we had with the aggregometer and gave us additional information on the behavior of monocytes in platelet thrombus formation. An important part was the study of viability and cytotoxicity of different cells, after their incubation with polyphenols. The results showed that all phenolic compounds in low concentrations (up to 20 μg/ml) do not affect the viability of both healthy cells and cancer cells and do not exert a cytotoxic effect. At higher concentrations, it was observed that phenolic compounds reduce cell viability and exert a cytotoxic effect, especially at a longer incubation time of 48 and 72 hours, respectively. The extracts were shown to have a selective effect on cancer cell lines. Some were active on HeLa cancer cells while others were inhibitory on MCF-7 cells. The study of the effect on the apoptotic mechanism of cancer cells showed that the polyphenols did not all have the same antitumor effect, but they exerted an effect on the apoptotic factors of the pathway. This was followed by in vivo experiments in which we studied the antiplatelet effect of polyphenols in experimental animals (mice). The results we obtained confirmed those of the in vitro experiments with both methods. In conclusion in the in vivo experiments there were no quantitative differences between the extracts and the phenolic compounds with the concentrations administered to the animals, the difference was in the flow time control, where the Goji berry extract had the greatest inhibitory effect on the formation of the clot. From the evaluation of all the results, it is suggested that further investigations should be carried out mainly in vivo with lower concentrations in order to study more targeted the beneficial effect of polyphenols on cells and in the future perhaps clinical studies on humans may be carried out. Also, risk/benefit studies should be conducted on the proper intake and effectiveness of polyphenols as health promotion agents or even used as anticancer drugs in targeted therapies.

Οι φαινολικές ενώσεις χαρακτηρίζονται ως προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας και βρίσκονται σε αφθονία σε πολλά φρούτα και λαχανικά. Είναι ευρέως γνωστά για τις σημαντικές βιολογικές δραστικότητές τους και την ευεργετική επίδραση που έχουν στην υγεία του ανθρώπου. Τα αιμοπετάλια παίζουν ένα κεντρικό ρόλο στην αιμόσταση και στον σχηματισμό των θρόμβων κυρίως μετά από τραυματισμό του ενδοθηλίου. Η συσσώρευση και ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και το σύμπλεγμα αιμοπετάλια-μονοπύρηνα μπορούν υπό μη φυσιολογικές συνθήκες του οργανισμού να οδηγήσουν σε καρδιαγγειακές παθήσεις ή αθηρωθρομβωτικά επεισόδια. Μια σειρά από φλαβονοειδή όπως η καμφερόλη, η κερκετίνη, η κατεχίνη, η επικατεχίνη, η μυρισετίνη, τρία φαινολικά οξέα, το καφεϊκό, το φερουλικό και το κουμαρικό και οι κύριες φαινολικές ενώσεις από ρόδι, στέμφυλα, ιπποφαές και Goggi berry, μελετήθηκαν για την επίδραση τους στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και μονοπύρηνων κυττάρων του ανθρώπου (πειράματα in vitro) και αρουραίων (πειράματα in vivo). Με βάση τα παραπάνω, στην παρούσα διατριβή, αρχικά μελετήθηκε η αντιαιμοπεταλιακή δράση των φαινολικών ενώσεων in vitro. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με δύο μεθόδους, με τη φωτομετρική μέθοδο (aggregometer) και με κυτταρομετρία ροής. Στα πειράματα αυτά βρέθηκε ότι όλες οι ουσίες είχαν ανασταλτική δράση στα αιμοπετάλια και στα μονοπύρηνα, με μικρές διαφοροποιήσεις στα αποτελέσματα. Η κυτταρομετρία ροής επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της αναστολής των αιμοπεταλίων που είχαμε με το συσσωρόμετρο αιμοπεταλίων (aggregometer) και μας έδωσε επιπλέον πληροφορίες για τη συμπεριφορά των μονοπύρηνων στο σχηματισμό του αιμοπεταλιακού θρόμβου. Σημαντικό μέρος της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της βιωσιμότητας και τοξικότητας των κυττάρων μετά την επώασή τους με τις φαινολικές ενώσεις και τα εκχυλίσματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλες οι φαινολικές ενώσεις σε χαμηλές συγκεντρώσεις (έως 20 μg/ml), δεν επηρεάζουν τη βιωσιμότητα τόσο των υγιών κυττάρων όσο και των καρκινικών κυττάρων και δεν ασκούν κυτταροτοξική δράση. Σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε ότι οι φαινολικές ενώσεις μειώνουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων και ασκούν κυτταροτοξική δράση ιδιαίτερα σε μεγαλύτερο χρόνο επώασης τους και συγκεκριμένα σε 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα. Τα εκχυλίσματα έδειξαν ότι είχαν επιλεκτική επίδραση στις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Κάποια ήταν δραστικά στα καρκινικά κύτταρα HeLa ενώ κάποια άλλα επιδρούσαν ανασταλτικά στα κύτταρα MCF-7. Η μελέτη επίδρασης στον αποπτωτικό μηχανισμό των καρκινικών κυττάρων έδειξε ότι οι πολυφαινόλες (φαινολικές ενώσεις) δεν είχαν όλες την ίδια αντικαρκινική δράση, ασκούσαν ωστόσο επίδραση σε αποπτωτικούς παράγοντες του μονοπατιού. Ακολούθησαν τα πειράματα in vivo στα οποία μελετήσαμε την αντιαιμοπεταλιακή δράση των πολυφαινολών σε πειραματόζωα (αρουραίους). Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν εκείνα των πειραμάτων in vitro και με τις δύο μεθόδους. Συμπερασματικά στα πειράματα in vivo δεν υπήρξαν ποσοτικές διαφορές ανάμεσα στα εκχυλίσματα και τις φαινολικές ενώσεις με τις συγκεντρώσεις που χορηγήθηκαν στα ζώα. Διαφοροποίηση υπήρξε στον έλεγχο του χρόνου ροής αίματος όπου το εκχύλισμα Goggi berry είχε την μεγαλύτερη ανασταλτική δράση στο σχηματισμό του θρόμβου. Από την αξιολόγηση όλων των αποτελεσμάτων προτείνεται ότι θα πρέπει να γίνουν περαιτέρω έρευνες κυρίως in vivo με συγκεντρώσεις μικρότερες από αυτές που χρησιμοποιήθηκαν, με σκοπό την εύρεση των πλέον δραστικών εξ αυτών. Αυτό θα οδηγήσει σε πιο στοχευμένες μελέτες, όπως μελέτη σχέσης βιολογικής δράσης-και δομής φαινολικών, μελέτες επίδρασης των πολυφαινολών στα κύτταρα και μελλοντικά και κλινικές μελέτες στον άνθρωπο για πιθανή χρήση τους ως αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων. Επίσης, θα πρέπει να πραγματοποιηθούν μελέτες κινδύνου/οφέλους για την σωστή λήψη και αποτελεσματικότητα των πολυφαινολών ως προαγωγή της υγείας ή ακόμα και να χρησιμοποιηθούν ως αντικαρκινικά φάρμακα σε στοχευμένες θεραπείες.