Comparative study of the regulatoty role of probiotic microoganisms in homeostasis and cell function

Abstract

Probiotics are live microorganisms, that when consumed in adequate amounts exert health benefits to the host. Although this definition is relatively recent, the use of probiotics has been practiced for centuries, oftentimes unknowingly. Ancient civilizations utilized them to ferment excess raw materials and produce novel foodstuffs with enhanced safety and organoleptic characteristics. At the same time, these products held great significance in traditional medicine, particularly in treating gastrointestinal (GI) diseases. Advancements in the microbiology field have supported the isolation and assessment of the properties of microorganisms found in these traditional fermented products. For a novel isolate to be characterized as probiotic a series of safety and functional criteria should be met. Firstly, it should be sensitive to common antibiotics and not carry transferable antibiotic resistance genes. Additionally, it must withstand host-related stresses, and be capable of at least, transiently colonizing the GI tract of the consumer. Whole genome sequencing (WGS) is also required for strains intended for use in the food chain. Common probiotic microorganisms include lactic acid bacteria (LAB), such as Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., and yeasts (i.e. Sacharomyces spp). Probiotic lactobacilli are Gram-positive, fastidious, non-motile, microorganisms that can be isolated from diverse sources; fermented products, environmental or host-associated niches. In the context of the host, lactobacilli predominantly colonize the small intestine and vagina. Reduction in their abundance has been linked to several intestinal and extraintestinal diseases, including inflammatory and functional disorders of the gut, localized and systemic infections, cancer and neurodegenerative diseases. The capacity of ingested lactobacilli to prevent or reverse these outcomes is a topic of intense research. Today, available preclinical and clinical data suggests that lactobacilli can exert strain-, host- and disease- specific activity. However, the molecular basis for these outcomes is not fully understood. The development and application of genomic and multi-omics methodologies has provided insight into their evolutionary history, probiotic and biotechnological potential. In this context, the accumulation of available WGS has led to the recent reclassification of the former Lactobacillus genus. Accordingly, transcriptomics and proteomics have supported the study of the probiotic character at multiple levels to generate mechanistic insight into lactobacilli-microbe and lactobacilli-host interactions. The aim of the present thesis was to investigate the strain-specific capacity of lactobacilli to affect cellular function and homeostasis, utilizing multi-disciplinary approaches. Lactiplantibacillus pentosus L33 (L33), Lactiplantibacillus plantarum L125 (L125) and Lacticaseibacillus paracasei SP5 (SP5) are three wild-type LAB strains, which have been previously isolated from fermented sausages and kefir grains, respectively. They were shown to exhibit basic probiotic attributes in vitro, including resistance to simulated GI tract conditions, sensitivity to common antibiotics and lack of hemolytic activity. Additionally, SP5 exhibits robust biotechnological potential, and has been incorporated into several dairy and non-dairy fermented products. The WGS of strains L33 and L125 have been previously published by our group. Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) and Lacticaseibacillus casei ATCC 393 (Lc393), two commercially available probiotic strains, were also incorporated in this study. Firstly, WGS was performed for SP5 to annotate genes involved in the probiotic and biotechnological potential of the strain. The strain carries a genome with a total length of 2,958,982 bp and a GC content of 46.3%. It does not contain plasmids or transposable elements, acquired antibiotic resistance genes or virulence factors. The nomadic character of the strain is reflected in the numerous clusters for carbohydrate transport and utilization, and in the lack of amino acid biosynthetic modules. To compensate for the lack of these clusters the strain carries extensive proteolytic systems. Furthermore, modules for thiamine and γ-aminobutyric acid (GABA) production were identified in the genome of the strain. Comparative pangenomics were utilized to investigate niche preference in lactobacilli. To this aim, the genome sequences of prominent free-living, host-associated and nomadic strains were analyzed. Shared genes between the three groups code for housekeeping, conserved functions, such as amino acid synthesis, carbohydrate metabolism and DNA repair mechanisms. Finally, pangenome-wide association analysis was performed to correlate niche preference with specific genetic loci. To this end, two hypothetical proteins were correlated with adaptation of Lp. plantarum strains in insect hosts. Probiotic lactobacilli can exert antimicrobial and antibiofilm activity against foodborne and clinically relevant pathogens, in a strain-specific manner. Specifically, matrix acidification, as well as the secretion of bacteriocins or of other small antimicrobial, including quorum quenching (QQ) molecules contribute to these phenotypes. At the same time, cell surface components may exert direct antimicrobial activity or participate in events of competitive exclusion from host mucosa. Furthermore, lactobacilli can trigger pathogen clearance mechanisms. In this context, the antimicrobial activity of the five strains against Staphylococccus aureus, Salmonella enterica and Escherichia coli, was examined in silico and in vitro. The WGS of the wild-type strains was searched for the presence of bacteriocins, and of other antimicrobial peptides. Comparative genomics were utilized to infer their functionality. Putative bacteriocins with high sequence and structural identity to functional peptides were identified in the genome of strains L33, L125 and SP5. The expression levels of these peptides were shown to be upregulated in co-incubation with specific pathogens. Next, the capacity of viable lactobacilli or their cell-free culture supernatant (CFCS) to inhibit pathogen viability and biofilm formation capacity was determined with microbiological methods and confocal microscopy. It was found that the unfractionated CFCS limited pathogen viability in a dose- and pH-dependent manner. Additionally, small peptides produced by the three wild-type strains were effective against S. aureus. Lactobacilli CFCS effectively limited biofilm mass and viability, with the higher inhibition being recorded for Lc. paracasei SP5 CFCS against S. enterica biofilms (>2.5 log reduction). These effects were attributed to the cytotoxic activity of the CFCS and the capacity of the lactobacilli-derived metabolites to modulate the expression of key genes involved in biofilm formation, in a pathogen-specific manner. Then, we sought to determine whether the lactobacilli that present direct antimicrobial activity can prevent infection in a cellular model. S. aureus and E. coli were found to exert cytotoxic effects in co-incubation with the human adenocarcinoma cell line HT-29 in a time-dependent manner. The capacity of the lactobacilli to prevent pathogen-induced cell death was examined in silico and in vitro. Among the tested strains, only L125 could prevent the detrimental effects of infection when in direct contact with the cells for 4h prior to pathogen challenge. These effects were comparable to those induced by LGG, a strain with well-documented capacity to limit S. aureus-induced cell death. The protective phenotype was attributed to the capacity of strain L125 to code for cell surface proteins that could participate in competitive exclusion events. Dual RNA-seq and protein microarrays were used to further explore this phenotype. Indeed, several L125 adhesins and moonlighting proteins were expressed in high levels during co-incubation with HT-29 cells. At the same time, pathways involved in actin rearrangement, endocytosis, pathogen adherence and invasion were downregulated in host cells. These findings suggest Lp. plantarum L125 can exclude pathogens from the host cell surface and prime resistance mechanisms to combat infection. In the context of the thesis, a novel method for the strain-specific identification of bacteria of interest with available WGS was developed. Specifically, unique genomic regions were identified with comparative genomics and used for primer design. The specificity of the generated primer sets was validated in silico and in vitro. In vitro, the primer sets are incorporated in multiplex PCR to produce a unique electrophoretic pattern for the target strain. Our group has successfully applied this method to detect strains L33, L125 and Lc. paracasei SRX10 in monocultures and fermented foodstuffs. Finally, our group developed Probio-ichnos, (probiotic + ichnos, or fingerprint in Greek), a manually curated, literature-based database for bacteria and fungi with in vitro probiotic attributes. As the number of available studies on probiotic microorganisms is increasing at an exponential rate, tools contributing to the comprehensive study of their properties have become indispensable. To this end, Probio-ichnos collects and comprehensively presents data on seven basic in vitro probiotic characteristics: survival in the GI tract, adherence capacity, antimicrobial, immunomodulatory, antiproliferative and antioxidant activity, for strains derived from diverse niches. Currently, the database contains 12,993 entries, for 11,202 strains belonging to 407 species and 143 genera, and 789 WGS. Probio-ichnos aims at supporting basic and applied research, as it facilitates comparative analysis between probiotics of interest and the identification of gaps or discrepancies in current literature. Overall, in this thesis the probiotic potential of three wild-type LAB stains isolated from fermented products was examined at greater depth, utilizing multidisciplinary approaches, including comparative genomics, pangenomics, microbiological assays, confocal microscopy, and omics platforms. At the same time, the probiotic profile of the two commercial probiotic strains, LGG and Lc393 was expanded. Finally, a novel method for bacterial identification at the strain level in complex samples, and a comprehensive database for strains with in vitro properties were developed. Future studies will focus on the validation of the strain-specific capacity of L125 to limit pathogen-induced cell death, utilizing complex in vitro (e.g. intestinal organoids) and in vivo (e.g. gnotobiotic mice) systems that incorporate microbial communities. Additionally, the application of lactobacilli CFCS as a decontamination means will be explored in situ.

Ως προβιοτικοί ορίζονται οι μικροοργανισμοί οι οποίοι όταν καταναλωθούν σε επαρκείς ποσότητες επιφέρουν θετικές επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή (FAO/WHO, 2001; Hill et al., 2014). Ο ορισμός αυτός διατυπώθηκε το 2001 από τον Οργανισμό Υγείας των Ηνωμένων Εθνών και τη Διεθνή Οργάνωση Τροφίμων και Υγείας, και επαναδιατυπώθηκε το 2014 από τη Διεθνή Επιστημονική Ένωση για τα Προβιοτικά και τα Πρεβιοτικά (Hill, et al., 2014). Αν και αυτός ο ορισμός είναι πρόσφατος, στην πραγματικότητα οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί χρησιμοποιούνται εδώ και χιλιετίες. Πράγματι, αναφορές σε προϊόντα ζύμωσης, ένα βασικό μέσο στο οποίο αναπτύσσονται αυτοί οι μικροοργανισμοί, υπάρχουν ήδη από το 4000 πΧ (Tamang et al., 2020). Τα προϊόντα ζύμωσης είναι πιο ανθεκτικά στην αλλοίωση σε θερμοκρασία δωματίου και έχουν διακριτά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Έτσι οι αρχαίοι πολιτισμοί μπορούσαν να επεκτείνουν τη διάρκεια ζωής των άφθονων πρώτων υλών, και να παρασκευάσουν ασφαλή προς κατανάλωση ποτά και τρόφιμα. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι προϊόντα όπως το κρασί χρησιμοποιούνταν εμπειρικά για την αντιμετώπιση γαστρεντερικών διαταραχών. Με την ανάπτυξη της μικροσκοπίας και του πεδίου της μικροβιολογίας, ανακαλύφθηκαν και απομονώθηκαν οι μικροοργανισμοί οι οποίοι συντελούν τη ζύμωση των πρώτων υλών. Παράλληλα, οι ευεργετικές για την υγεία επιδράσεις αυτών των προϊόντων καταγράφηκαν συστηματικά για πρώτη φορά από τον Ellie Metchnikoff. Ο ίδιος, δημοσίευσε το 1907 το βιβλίο με τίτλο «The Prolongation of Life» στο οποίο διατύπωσε ότι η κατανάλωση τροφίμων πλούσιων σε «ευεργετικούς μικροοργανισμούς» έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση αυτοτοξινών στο έντερο που προέρχονται από την Δυτικού τύπου διατροφή (Mackowiak, 2013). Ενώ οι αντιλήψεις αυτές είχαν εγκαταλειφθεί για πολλά χρόνια κατά τα οποία η ανθρωπότητα πλήχθηκε από επιδημίες και λοιμώξεις στο πεδίο της μάχης, την τελευταία δεκαετία οι ιδιότητες των ευεργετικών μικροοργανισμών μελετώνται, πλέον, συστηματικά. Παράλληλα, η αγορά των προβιοτικών μικροοργανισμών είναι ιδιαίτερα επικερδής, με την αξία της να αναμένεται να ξεπεράσει τα 100 δις δολάρια μέχρι το 2029. Με την ανάπτυξη του πεδίου των προβιοτικών μικροοργανισμών έχουν καθιερωθεί οδηγίες και κανονιστικά πλαίσια για την προστασία του καταναλωτή. Συγκεκριμένα, για να θεωρηθεί ένας νέος μικροοργανισμός ως προβιοτικός θα πρέπει να πληροί συγκεκριμένα κριτήρια ασφάλειας και λειτουργικότητας. Πιο συγκεκριμένοι, οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί πρέπει να είναι ευαίσθητοι σε κοινά αντιβιοτικά και να μην έχουν την ικανότητα σύνθεσης λοιμογόνων παραγόντων και μεταφοράς γονιδίων ανθεκτικότητας σε μικρόβια της μικροχλωρίδας του ξενιστή. Παράλληλα, τα προβιοτικά στελέχη θα πρέπει να είναι ανθεκτικά στις συνθήκες του γαστρεντερικού συστήματος, και να έχουν την ικανότητα παροδικού αποικισμού του (Hill et al., 2014). Οι μικροοργανισμοί οι οποίοι προορίζονται για χρήση στη βιομηχανία τροφίμων θα πρέπει να είναι επιπλέον ανθεκτικοί στο ωσμωτικό σοκ, σε αερόβιες συνθήκες και ακραίες θερμοκρασίες έτσι ώστε να διασφαλιστεί η βιωσιμότητα τους κατά την παρασκευή, αποθήκευση και διακίνηση των τελικών προϊόντων. Σχετικά με τις λειτουργικές τους ικανότητες, οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί μπορούν να παρουσιάζουν αντιμικροβιακή, ανοσορρυθμιστική ή/και αντιοξειδωτική δράση (Binda et al., 2020). Τα πιο κοινά γένη στα οποία ανήκουν προβιοτικοί μικροοργανισμοί είναι τα Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., και Saccharomyces spp. Οι προβιοτικοί λακτοβάκιλλοι συναντώνται ελεύθεροι στη φύση ή σε συσχέτιση με κάποιον ξενιστή, ενώ είναι βασικά συστατικά της μικροχλωρίδας προϊόντων ζύμωσης (Duar et al., 2017). Ως μέλη της εντερικής και κολπικής μικροχλωρίδας συμμετέχουν σε βασικές διεργασίες εξασφαλίζοντας την ομοιοστατική τους λειτουργία. Πράγματι, σύγχρονες μελέτες καταδεικνύουν ότι η μείωση στον πληθυσμό τους συσχετίζεται με εντερικές και εξωεντερικές διαταραχές, όπως φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου, τοπικές και συστημικές λοιμώξεις, τον καρκίνο, ακόμη και νευροεκφυλιστικές νόσους (Olejniczak-Staruch et al., 2021). Έτσι, τα τελευταία χρόνια διερευνάται σε εντατικούς ρυθμούς η συνεισφορά της εξωγενούς χορήγησης προβιοτικών λακτοβακίλλων στην πρόληψη και αντιμετώπιση αυτών των ασθενειών. Τα υπάρχοντα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η προβιοτική δράση των λακτοβακίλλων είναι στελεχοειδική και επηρεάζεται από παράγοντες ειδικούς για κάθε ξενιστή (π.χ. ηλικία, φύλο, γενετική σύσταση, συνυπάρχουσες ασθένειες). Η μοριακή βάση αυτών των αλληλεπιδράσεων δεν είναι απόλυτα κατανοητή. Σήμερα, η εξέλιξη των ομικών τεχνολογιών και σύνθετων in vitro μοντέλων έχουν συντελέσει στην κατανόηση της εξελικτικής ιστορίας των προβιοτικών λακτοβακίλλων, καθώς και στην περιγραφή των αλληλεπιδράσεων με άλλα βακτήρια και τον ξενιστή σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο (Kiousi et al., 2021). Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο τη συγκριτική μελέτη των μοριακών και κυτταρικών αλληλεπιδράσεων τριών στελεχών αγρίου τύπου απομονωμένων από παραδοσιακά προϊόντα ζύμωσης. Πιο συγκεκριμένα τα στελέχη Lactiplantibacillus pentosus L33 (L33), Lp. plantarum L125 (L125) και Lc. paracasei SP5 (SP5) προέρχονται από προϊόντα κρέατος και κεφίρ, αντίστοιχα (Pavli et al., 2016; Mantzourani et al., 2019). Τα στελέχη αυτά εμφανίζουν προβιοτικά χαρακτηριστικά in vitro: αντοχή στα οξέα και τα χολικά άλατα, ευαισθησία σε κοινά αντιβιοτικά και έλλειψη αιμολυτικής δράσης. Το στέλεχος SP5 παρουσιάζει επιπλέον ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον, καθώς έχει ενσωματωθεί σε πληθώρα γαλακτοκομικών και μη- προϊόντων (Mantzoiurani et al., 2023; Bontsidis et al., 2022; Plessas et al., 2021; Kazakos et al., 2022). Πρόσφατα η ερευνητική μας ομάδα έχει δημοσιεύσει τη γονιδιωματική αλληλουχία των στελεχών L33 (Stergiou et al., 2021) και L125 (Tegopoulos et al., 2021). Στην παρούσα διατριβή έχουν επίσης μελετηθεί και οι ιδιότητες των εμπορικών προβιοτικών στελεχών Lc. rhamnosus GG (LGG) και Lc. casei ATCC 393 (Lc393). Αρχικά, το γονιδίωμα του στελέχους SP5 αλληλουχήθηκε για τον εντοπισμό γονιδίων που εμπλέκονται στο προβιοτικό και βιοτεχνολογικό δυναμικό του. Το στέλεχος αυτό έχει γονιδίωμα μήκους 2,958,982 bp και περιεκτικότητας σε βάσεις GC 46.3%. Κατά τη γονιδιωματική ανάλυση δεν βρέθηκαν πλασμίδια ή άλλα μεταθετά στοιχεία, καθώς και γονίδια επίκτητης αντοχής στα αντιβιοτικά. Ο νομαδικός χαρακτήρας του στελέχους αντικατοπτρίζεται στις πολλαπλές κασέτες για την ενδοκυττάρωση και τον μεταβολισμό ετερογενών πολυσακχαριτών, καθώς και στην περιορισμένη παρουσία βιοσυνθετικών μονοπατιών για αμινοξέα. Παρόλαυτα, το στέλεχος SP5 διαθέτει πολλαπλά πρωτεολυτικά ένζυμα για την παραλαβή αμινοξέων από εξωγενείς πηγές. Προκειμένου να μελετηθεί η προτίμηση των λακτοβακίλλων για συγκεκριμένα περιβάλλοντα, διενεργήθηκε συγκριτική πανγονιδιωματική ανάλυση. Πιο συγκεκριμένα υπολογίστηκε το πανγονιδίωμα στελεχών που ζουν ελεύθερα στο περιβάλλον, στελεχών τα οποία αποικίζουν ξενιστές, καθώς και νομαδικών στελεχών, και έγιναν συσχετίσεις μεταξύ των γονιδίων και της πηγής απομόνωσης τους. Έτσι ανιχνεύθηκαν δύο υποθετικές πρωτεΐνες οι οποίες συσχετίζονται με την προτίμηση στελεχών του είδους Lp. plantarum για διαβίωση στο εντερικό επιθήλιο εντόμων. Μία από τις πιο διαδεδομένες ιδιότητες προβιοτικών λακτοβακίλλων είναι να εμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό και την εγκαθίδρυση ανταγωνιστικών μικροοργανισμών στο περιβάλλον τους. Για να το πετύχουν αυτό παράγουν πληθώρα αντιμικροβιακών μεταβολιτών, όπως γαλακτικό οξύ και οργανικά οξέα βραχέας αλύσου, καθώς και μικρών πεπτιδίων ή βακτηριοσινών (Arques et al., 2015). Παράλληλα, πολλά προβιοτικά στελέχη μπορούν να εμποδίζουν τον αποικισμό του επιθηλίου του ξενιστή από παθογόνα ή να ρυθμίζουν τις ανοσοαποκρίσεις προωθώντας την εκκαθάριση της λοίμωξης (Llewellyn and Foey, 2017). Σε αυτό το πλαίσιο, η αντιμικροβιακή δράση των τριών στελεχών αγρίου τύπου και των δύο εμπορικά διαθέσιμων προβιοτικών ελέγχθηκε έναντι των παθογόνων Staphylococcus aureus, Salmonella enterica και Escherichia coli. Αρχικά, μελετήθηκε η παρουσία γονιδίων για την παραγωγή βακτηριοσινών και άλλων πρωτεϊνών με αντιμικροβιακή δράση στο γονιδίωμα των πέντε στελεχών. Έτσι, στο γονιδίωμα των τριών στελεχών αγρίου τύπου εντοπίστηκαν οπερόνια βακτηριοσινών με υψηλή ομοιότητα σε επίπεδο αλληλουχίας και δομής με χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες από συγγενικά στελέχη. Πιο συγκεκριμένα, στο γονιδίωμα του στελέχους L33 βρέθηκε πλήρες οπερόνιο για την παραγωγή της πλανταρισίνης NC8, στο γονιδίωμα του στελέχους L125 για την πλανταρισίνη EF, ενώ στο γονιδίωμα του SP5 βρέθηκαν πολλαπλές αντιμικροβιακές πρωτεΐνες, όπως τα πεπτίδια LSEI-2392/2393 και αμιδάσες με ικανότητα διάσπασης του κυτταρικού τοιχώματος. Η έκφραση αυτών των πεπτιδίων αυξήθηκε σε συνεπώαση με τα παθογόνα-στόχους. Πρέπει να αναφερθεί ότι δεν βρέθηκαν αντίστοιχα πεπτίδια στο γονιδίωμα του LGG σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορες (De Keersmaecker et al., 2006; Kang et al., 2020), ενώ στο γονιδίωμα του Lc393 βρέθηκε ένα πεπτίδιο το οποίο παρουσίασε μικρή γενετική και δομική ομοιότητα με χαρακτηρισμένες βακτηριοσίνες. Η αντιμικροβιακή ικανότητα των λακτοβακίλλων και των μεταβολιτών (cell-free culture superantants, CFCS) τους ελέγχθηκε in vitro με κλασικές μικροβιολογικές τεχνικές και συνεστιακή μικροσκοπία. Πιο συγκεκριμένα, επίδραση με το CFCS μείωσε τη βιωσιμότητα και την ικανότητα των παθογόνων να δημιουργούν βιοϋμένια σε στερεές επιφάνειες, με δόσο- και pH- εξαρτώμενο τρόπο. Η μεγαλύτερη μείωση της βιωσιμότητας καταγράφηκε έναντι της S. enterica μετά από επίδραση με CFCS από το στέλεχος SP5. Παράλληλα, μείωση στην έκφραση βασικών ρυθμιστών της δημιουργίας βιοϋμενίων παρατηρήθηκε μετά από επιδράσεις με CFCS. Συμπερασματικά, η ικανότητα των λακτοβακίλλων να περιορίζουν τον σχηματισμό βιοϋμενίων αποδίδεται κυρίως στην παραγωγή αντιμικροβιακών μεταβολιτών και δευτερευόντως στη μεταβολή έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή τους. Στη συνέχεια, η ικανότητα των λακτοβακίλλων να προλαμβάνουν τη λοίμωξη από τα τρία παθογόνα εξετάστηκε σε κυτταρικά μοντέλα. Αρχικά βρέθηκε ότι οι S. aureus και E. coli ασκούν κυτταροτοξική δράση σε συνεπώαση με την κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος του εντέρου HT-29. Από τα βακτήρια που εξετάστηκαν, το στέλεχος L125 απέτρεψε τον κυτταρικό θάνατο σχετιζόμενο με τη μόλυνση, μετά από συνεπώαση με τα κύτταρα HT-29, για 4 ώρες. Ο προστατευτικός φαινότυπος ήταν συγκρίσιμος με αυτόν του στελέχους LGG, το οποίο έχει καλά μελετημένη ικανότητα να μειώνει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το παθογόνο S. aureus (El-Chami et al., 2022; Spacova et al., 2022). Η δράση του στελέχους L125 αποδόθηκε στην ικανότητα του να αποκλείει την προσκόλληση και την ενδοκυττάρωση των παθογόνων στα επιθηλιακά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, κατά την περίοδο της προεπώασης, το στέλεχος αυτό προσκολλάται στα επιθηλιακά κύτταρα, μέσω των επιφανειακών του πρωτεϊνών που περιέχουν περιοχές με συγγένεια για πρωτεΐνες του ξενιστή και μόρια της εξωκυττάριας μήτρας. Πράγματι, προσομειώσεις σύνδεσης (protein-protein docking) κατέδειξαν ότι οι επιφανειακές, αυτές, πρωτεΐνες παρουσιάζουν ικανότητα αλληλεπίδρασεις με μουκίνες, υποδοχείς τύπου Toll (Τoll-like receptors, TLRs), φιμπρονεκτίνες και ιντιμίνες. Πρέπει να αναφερθεί ότι οι πρωτεΐνες αυτές, παρουσιάζουν υψηλή ομοιότητα με αυτές που κωδικοποιούνται από τα παθογόνα, οπότε μπορούν να συμμετέχουν στον ανταγωνιστικό αποκλεισμό της προσκόλλησής τους. Εκτός από περιοχές αγκυροβόλησης των βακτηριών, αυτοί οι προσδέτες εμφανίζουν ανοσορρυθμιστική ικανότητα, ενώ επίσης συμμετέχουν και στην αναδιοργάνωση του κυτταρικού σκελετού και τον πολλαπλασιασμό και χρησιμοποιούνται από παθογόνα βακτήρια για την ενδοκυττάρωση τους στο κύτταρο στόχο. Το μεταγραφωματικό προφίλ των L125 και HT-29 κυττάρων κατά τη διάρκεια της συνεπώασης τους μελετήθηκε με αλληλούχιση RNA (dual RNA-seq). Πιο συγκεκριμένα, στο στέλεχος L125 παρατηρήθηκε αύξηση των μεταγράφων που κωδικοποιούν για επιφανειακές προσκολλητίνες, ενώ στα κύτταρα του ξενιστή παρατηρήθηκε μείωση των μεταγράφων για πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται στην προκόλληση και ενδοκυττάρωση βακτηριακών παθογόνων. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συνεπώαση με το στέλεχος L125 δεν προκάλεσε ανοσορυθμιστικές αλλαγές σε επίπεδο μεταγραφώματος, ενώ μείωσε την απέκκριση κυτταροκινών στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι το στέλεχος L125 το οποίο διαθέτει αντιμικροβιακή δράση, μπορεί να εμποδίζει τον αποικισμό και τη μολυσματικότητα βακτηριακών παθογόνων μέσω ανταγωνιστικού αποκλεισμού και τροποποίησης μονοπατιών ενδοκυττάρωσης του ξενιστή. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής η ομάδα μας ανέπτυξε μία νέα μεθοδολογία για τον εντοπισμό στελεχών ενδιαφέροντος σε σύνθετα δείγματα. Η στελεχοειδική ανίχνευση βακτηρίων μπορεί να βρει εφαρμογή τόσο στη βιομηχανία τροφίμων, όσο και στη βασική και εφαρμοσμένη έρευνα. Πιο συγκεκριμένα, η ανίχνευση σε προϊόντα ζύμωσης επιτρέπει την παρακολούθηση της βιωσιμότητας στελεχών ενδιαφέροντος κατά τις διαφορετικές φάσεις της παρασκευής, αποθήκευσης και διακίνησης των προϊόντων. Παράλληλα, ο εντοπισμός συγκεκριμένων στελεχών στο μικροβίωμα του ξενιστή επιτρέπει την καλύτερη μελέτη των βιολογικών τους ιδιοτήτων. Οι διαθέσιμες μοριακές μέθοδοι για βακτηριακή ανίχνευση, όπως η ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου [pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)], και η πολυτοπική τυποποίηση αλληλουχίας [multi-locus sequence typing (MLST)] είναι χρονοβόρες και κοστοβόρες, με χαμηλή ικανότητα διάκρισης στο επίπεδο στελέχους (Prete et al., 2021; Karapetsas et al., 2010). Η αυξημένη προσβασιμότητα σε γονιδιωματικές αλληλουχίες βακτηρίων δίνει την ικανότητα ανάπτυξης νέων τεχνικών με αυξημένη διακριτική ικανότητα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιεί αλγορίθμους συγκριτικής γονιδιωματικής για την ανίχνευση αλληλουχιών οι οποίες είναι μοναδικές για το στέλεχος ενδιαφέροντος. Οι περιοχές αυτές χρησιμοποιούνται για τον σχεδιασμό εκκινητών οι οποίοι παράγουν ένα ειδικό, στελεχοειδικό μοτίβο σε πήκτωμα αγαρόζης μετά από πολυπλεκτική αντίδραση PCR (multiplex PCR). Η μεθοδολογία αυτή έχει επιτυχώς χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των στελεχών L33, L125 (Kiousi et al., 2023) και Lc. paracasei SRX10 (Kamarinou et al., 2024) σε καθαρές καλλιέργειες και προϊόντα ζύμωσης. Τέλος, η ομάδα μας ανέπτυξε μια βάση δεδομένων η οποία συγκεντρώνει και παρουσιάζει μελέτες για τις in vitro προβιοτικές ικανότητες μικροβιακών στελεχών. Σήμερα, η σχετική βιβλιογραφία αυξάνεται εκθετικά, και έτσι ο μεγάλος όγκος της διαθέσιμης πληροφορίας δυσχεραίνει την εύρεση και αξιολόγηση των υπαρχουσών ερευνών. Για τον λόγο αυτό, δημιουργήσαμε την Probio-ichnos, μια μη-αυτόματη βάση δεδομένων που βασίζεται στη διαθέσιμη βιβλιογραφία, και παρουσιάζει στελέχη τα οποία έχουν μελετηθεί ή/και παρουσιάζουν εφτά βασικά χαρακτηριστικά: αντοχή στα οξέα και στα χολικά άλατα, ικανότητα προσκόλλησης, αντιμικροβιακή, ανοσορρυθμιστική, αντιπολλαπλασιαστική ή/και αντιοξειδωτική δράση. Κατά τη συγγραφή της παρούσας διδακτορικής διατριβής, η Probio-ichnos περιέχει 12,993 καταχωρήσεις, για 11,202 στελέχη τα οποία ανήκουν σε 407 είδη και 143 γένη. Επιπρόσθετα, η Probio-ichnos εμπεριέχει 789 γονιδιώματα. Τα στοιχεία για κάθε χαρακτηριστικό και βακτηριακό στέλεχος παρουσιάζονται με ποιοτικό τρόπο, με βάση τα συμπεράσματα των συγγραφέων από τις μελέτες από τις οποίες αντλήθηκαν τα δεδομένα. Η Probio-ichnos επιτρέπει τη συγκριτική μελέτη μικροοργανισμών ενδιαφέροντος, ενώ παράλληλα υποστηρίζει τον εντοπισμό διφορούμενων αποτελεσμάτων ή και ελλείψεων στα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα. Παράλληλα, μέσω της βάσης μπορούν να εντοπιστούν πιθανά προβιοτικά στελέχη με επαναλήψιμα αποτελέσματα τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως στελέχη-μάρτυρες για την αξιολόγηση των προβιοτικών ιδιοτήτων νέων στελεχών. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στην πολυεπίπεδη μελέτη των προβιοτικών χαρακτηριστικών τριών λακτοβακίλλων αγρίου τύπου και δύο εμπορικών στελεχών, με τη χρήση in silico, in vitro και ομικών τεχνολογιών. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε ένα καινούργιο εργαλείο που διευκολύνει τη στελεχοειδική ανίχνευση βακτηρίων ενδιαφέροντος με πιθανή εφαρμογή τόσο στη βιομηχανία τροφίμων όσο και στη βασική και εφαρμοσμένη έρευνα, και η Probio-ichnos, μια βάση δεδομένων που υποστηρίζει τη συγκριτική μελέτη προβιοτικών μικροοργανισμών και των ιδιοτήτων τους. Η εις βάθος κατανόηση του προβιοτικού δυναμικού στελεχών ενδιαφέροντος σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο αποτελεί εφαλτήριο για την επιτυχή ενσωμάτωση τους στην κλινική πράξη.