Design, Development and evaluation of exosome-inspired nanoparticles as drug delivery nanosystems and their biomedical applications

Abstract

The role of extracellular vesicles (EVs) in intracellular and intercellular communication has proved to be of paramount importance in health and disease. EVs can be classified into subcategories based on their biogenesis background and size. Exosomes belong to small EVs and their production machineries allow for selective cargo loading, always associated with the condition of the producer cell. EV production is generally a dynamic process, reflecting the de novo production as well as the internalization of external EVs. Based on a spatiotemporal communication system, EVs can change the phenotype of the recipient cell, protect it from impending danger, or trigger the display of pathogenies. Recently, EVs were proposed to fall under the long-distance, contact-dependent mechanism of cell-to-cell communication. However, why they are preferred by nature as information carriers still remains unsolved. EVs seem to excel among other ways of intercellular signal transmission due to their combined characteristics to deliver information with high sensitivity and specificity while simultaneously consuming low energy. This seems energetically favorable for both the producer and the receptor cells that might interact with EVs through lateral diffusion, amplifying the intensity of transmitted signals. Currently, fundamental questions regarding EV biogenesis, interaction with receptor cell and their overall fate remain to be deciphered. While EVs play an immerse role in cell-to-cell communication, science around the field of drug delivery systems (DDSs) focus on eliminating common drawbacks of synthetic nanoparticles such as toxicity, low circulation time and insufficient targeting properties. Under this scope many researchers focus on evaluating the utilization of EVs as DDSs and indeed, there are currently manifold active clinical trials on EV-based therapeutics. However, in contrast to lipid-based nanoparticles and especially the well-established category of liposomes, EVs present significant limitations in their translation to clinical practice. Low isolation yields, selection of the best parent cell type, and lack of detailed evaluation of short- and long- term toxicity due to their complex cargo, are some of the main disadvantages when compared to lipid-based nanoparticles. Among the pathological conditions that Pharmaceutical Nanotechnology holds great promise is the treatment of neurodegenerative diseases. Lipid-based nanoparticles could have beneficial effects on the progression of neurodegenerative diseases, particularly Alzheimer’s disease (AD), where current therapies are primarily symptomatic and fail to address the underlying causes. Inspired by the above, our group set out to design and develop biomimetic liposomes based on some key membrane properties of EVs, which form the central objective of this doctoral thesis. Firstly, we emphasized on developing an artificial membrane model suitable for the thermodynamic evaluation of lipid raft formation. By selecting key lipid molecules that are enriched on the EV membranes, we were able to study the effect of its molecule on the fluidity and homogeneity of various lipid bilayers. Building on the calorimetric results, the design and development of lipid and lipid-polymer exosome-inspired nanoparticles was achieved. In this stage, genistein, a non-selective tyrosine kinase inhibitor was incorporated into our nanoparticles. Genistein was selected due to its beneficial role in neuroinflammation and oxidative stress derived from neurons. A detailed characterization by a gamut of different techniques, including dynamic and electrophoretic light scattering, fluorescence anisotropy, circular dichroism, and cryogenic transmission electron microscopy, allowed for the optimization of both lipid and chimeric lipid-polymer exosome-inspired nanoparticles. The stability, membrane fluidity, interaction with human serum albumin, and morphology evaluation support that the developed colloidal nano-dispersions meet the specifications of an efficient drug delivery platform. In the last experimental section, the nanotoxicity of the liposomal formulations was assessed in three different cell lines. Firstly, non-toxic carrier and genistein doses were determined in HEK293 cell line. Continuously, the viability of wild-type and AD-neurons derived from human induced pluripotent stem cells (h-IPSCs) was studied after treatment with non-loaded and genistein-loaded exosome-inspired nanoformulations. The results showed a selective viability reduction for AD-neurons when treated with the genistein-loaded lipid exosome-inspired nanoparticles, an effect not observed for the other cases. Finally, high similarity in size and size-distribution was observed between exosome-inspired nanoparticles and EVs isolated from WT-neurons derived from h-IPSCs, as determined by nano-flow cytometry and single-particle interferometric reflectance imaging sensor. This doctoral thesis aims to provide pioneering insights in the field of Pharmaceutical Technology, especially Pharmaceutical Nanotechnology, by developing efficient genistein-loaded exosome-inspired nanoparticle DDSs.

Ο ρόλος των εξωκυτταρικών κυστιδίων ( extracellular vesicles, EVs) στην ενδοκυτταρική και διακυτταρική επικοινωνία έχει αποδειχθεί εξαιρετικά σημαντικός τόσο σε καταστάσεις υγείας όσο και ασθενείας. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια μπορούν να ταξινομηθούν σε υποκατηγορίες με βάση τους μηχανισμούς βιογένεσης και το μέγεθός τους. Τα εξωσώματα ανήκουν στα μικρά εξωκυτταρικά κυστίδια και οι μηχανισμοί παραγωγής τους επιτρέπουν τον επιλεκτικό εγκλωβισμό φορτίου, πάντα σε σχέση με την κατάσταση του παραγωγού κυττάρου. Η παραγωγή των εξωκυτταρικών κυστιδίων αποτελεί γενικά μια δυναμική διαδικασία, η οποία αντανακλά τόσο την de novo παραγωγή όσο και την ενδοκυττάρωση εξωγενών εξωκυτταρικών κυστιδίων. Χρησιμοποιώντας ένα χωροχρονικό σύστημα επικοινωνίας, τα εξωκυτταρικά κυστίδια μπορούν να αλλάξουν το φαινότυπο του κυττάρου δέκτη, να το προστατεύσουν από επικείμενους κινδύνους ή να προκαλέσουν την εμφάνιση παθολογικών καταστάσεων. Πρόσφατα προτάθηκε ότι τα εξωκυτταρικά κυστίδια εμπίπτουν στον μηχανισμό επικοινωνίας μεταξύ κυττάρων από απόσταση και με επαφή (long-distance, contact-dependent). Ωστόσο, ο λόγος που επιλέγονται από τη φύση ως φορείς πληροφοριών παραμένει άγνωστος. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια φαίνεται να υπερέχουν σε σχέση με άλλους τρόπους διακυτταρικής μετάδοσης σημάτων λόγω του συνδυασμού χαρακτηριστικών που επιτρέπουν τη μετάδοση πληροφοριών με υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση, ενώ καταναλώνουν ελάχιστη ενέργεια. Αυτό φαίνεται να είναι ενεργειακά ευνοϊκό τόσο για το κύτταρο-παραγωγό όσο και για το κύτταρο-δέκτη, το οποίο ενδέχεται να αλληλεπιδράσει με τα εξωκυτταρικά κυστίδια μέσω πλευρικής διάχυσης, ενισχύοντας την ένταση των μεταδιδόμενων σημάτων. Επί του παρόντος, βασικά ερωτήματα σχετικά με τη βιογένεση των εξωκυτταρικών κυστιδίων, την αλληλεπίδραση με τα κύτταρα-δέκτες και την επικείμενη μοίρα τους παραμένουν αδιευκρίνιστα. Τη στιγμή που η έρευνα γύρω από τους μηχανισμούς επικοινωνίας μέσω των εξωκυτταρικών κυστιδίων ανθίζει, η επιστήμη στον τομέα των συστημάτων χορήγησης φαρμάκων προσανατολίζεται στην εξάλειψη κοινών μειονεκτημάτων των συνθετικών νανοσωματιδίων, όπως είναι η τοξικότητα, ο χαμηλός χρόνος κυκλοφορίας και οι ανεπαρκείς ιδιότητες στόχευσης. Υπό αυτό το πρίσμα, πολλοί ερευνητές επικεντρώνονται στην αξιολόγηση της χρήσης των εξωκυτταρικών κυστιδίων ως συστήματα μεταφοράς φαρμακομορίων και όντως, σήμερα πολλές κλινικές δοκιμές για θεραπευτικά σχήματα βασισμένα σε αυτά είναι σε εξέλιξη. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα νανοσωματίδια που βασίζονται σε λιπίδια, και ιδιαίτερα την καθιερωμένη κατηγορία των λιποσωμάτων, τα εξωκυτταρικά κυστίδια παρουσιάζουν σημαντικούς περιορισμούς στην κλινική τους εφαρμογή. Οι χαμηλές αποδόσεις απομόνωσης, η επιλογή του καλύτερου τύπου γονικού κυττάρου και η ελλιπής αξιολόγηση της βραχυπρόθεσμης και μακροπρόθεσμης τοξικότητας λόγω του πολύπλοκου φορτίου τους, αποτελούν μερικά από τα κύρια μειονεκτήματα σε σύγκριση με τα νανοσωματίδια που βασίζονται σε λιπίδια. Μεταξύ των παθολογικών καταστάσεων στις οποίες η Φαρμακευτική Νανοτεχνολογία έχει σημαντικές προοπτικές είναι η θεραπεία των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Τα νανοσωματίδια που βασίζονται σε λιπίδια θα μπορούσαν να έχουν ευεργετικά αποτελέσματα σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες, και ειδικά σε παθήσεις όπως η νόσος Alzheimer (Alzheimer’s disease, AD), όπου οι τρέχουσες θεραπείες είναι κυρίως συμπωματικές και δεν αντιμετωπίζουν τις υποκείμενες βασικές αιτίες. Εμπνευσμένη από τα παραπάνω, η ομάδα μας σχεδίασε και ανέπτυξε βιομιμητικά λιποσώματα βασισμένα σε βασικές ιδιότητες της μεμβράνης των εξωκυτταρικών κυστιδίων. Το παρόν αποτέλεσε και τον κύριο στόχο αυτής της διδακτορικής διατριβής. Πρώτον, επικεντρωθήκαμε στην ανάπτυξη ενός τεχνητού μοντέλου μεμβράνης ικανού να αξιολογεί τον σχηματισμό λιπιδικών πεδίων (μετασταθερές καταστάσεις) συγκεκριμένης σύστασης (lipid rafts) καθώς και τη θερμοδυναμική τους συμπεριφορά. Επιλέγοντας βασικά λιπίδια με τα οποία είναι εμπλουτισμένες οι μεμβράνες των εξωκυτταρικών κυστιδίων και δοκιμάζοντας μια ποικιλία διαφορετικών αναλογιών των βιοϋλικών, καταφέραμε να μελετήσουμε τον σχηματισμό λιπιδικών πεδίων, παρατηρώντας την ενθαλπία και τη θερμοκρασία μετάβασης διαφορετικών θερμοδυναμικών επιτόπων που σχηματίζονται στην ίδια λιπιδική διπλοστιβάδα. Λαμβάνοντας υπόψιν τα θερμοδυναμικά αποτελέσματα, επιτεύχθηκε ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη λιπιδικών και υβριδικών λιπιδικών-πολυμερικών νανοσωματιδίων εμπνευσμένων από εξωσώματα. Σε αυτό το στάδιο, η γενιστεΐνη, ένας μη-εκλεκτικός αναστολέας τυροσινικής κινάσης, ενσωματώθηκε στα νανοσωματίδια. Η γενιστεΐνη επιλέχθηκε λόγω του ευεργετικού της ρόλου στη νευροφλεγμονή και στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από κύτταρα του νευρικού συστήματος. Ο λεπτομερής χαρακτηρισμός με ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών τεχνικών, όπως η δυναμική και ηλεκτροφορετική σκέδαση φωτός, η ανισοτροπία φθορισμού, ο κυκλικός διχρωϊσμός και η κρυογονική μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίων, επέτρεψε τη βελτιστοποίηση τόσο των λιπιδικών όσο και των υβριδικών λιπιδικών-πολυμερικών νανοσωματιδίων εμπνευσμένων από εξωσώματα. Οι πραγματοποιηθείσες μελέτες σταθερότητας, ρευστότητας της μεμβράνης, αλληλεπίδρασης με αλβουμίνη ανθρώπινου ορού και μορφολογικού χαρακτηρισμού καθιστούν σαφές ότι η ανεπτυγμένη κολλοειδής νανοδιασπορά πληροί τις προδιαγραφές ανάπτυξης μιας αποδοτικής πλατφόρμας μεταφοράς φαρμακομορίων. Στο τελευταίο πειραματικό στάδιο της παρούσας εργασίας, αξιολογήθηκε η νανοτοξικότητα των λιποσωμικών σκευασμάτων σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Αρχικά, καθορίστηκαν οι μη τοξικές δόσεις τόσο του φορέα όσο και της γενιστεΐνης στη κυτταρική σειρά HEK293. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η βιωσιμότητα των φυσιολογικών (wild type, WT) νευρώνων και των AD-νευρώνων που έχουν προέλθει από ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (human induced pluripotent stem cells, h-IPSCs) μετά από επώαση με κενά και πληρωμένα με γενιστεΐνη νανοσωματίδια εμπνευσμένα από εξωσώματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν μείωση της βιωσιμότητας των AD-νευρώνων μετά την έκθεση σε λιπιδικά νανοσωματίδια με εγκλωβισμένη γενιστεΐνη, ένα φαινόμενο που δεν παρατηρήθηκε στις άλλες μελετηθείσες περιπτώσεις. Τέλος, καθορίστηκε μέσω νανο-κυτταρομετρίας ροής και αισθητήρα απεικόνισης παρεμβολών μονοσωματιδίων, η υψηλή ομοιότητα του μεγέθους και της κατανομής μεγέθους των παρασκευασθέντων νανοσωματιδίων και των εξωκυτταρικών κυστιδίων που απομονώθηκαν από WT-νευρώνες που προέρχονται από h-IPSCs. Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί να προσφέρει πρωτοποριακές γνώσεις στον τομέα της Φαρμακευτικής Τεχνολογίας και ειδικά της Φαρμακευτικής Νανοτεχνολογίας, με την ανάπτυξη αποδοτικών και ασφαλών συστημάτων μεταφοράς φαρμακομορίων που βασίζονται σε πληρωμένα με γενιστεΐνη νανοσωματίδια εμπευσμένων από εξωσώματα.