Microbial production and applications of carotenoids

Abstract

This thesis focuses on the production of microbial carotenoids using novel red yeast strains, coupled with efficient and environmentally friendly recovery methods, targeting high-value applications in food and pharmaceuticals. Carotenoids are bioactive compounds known for their vibrant color range and beneficial biological properties, making them especially valuable for the rapidly evolving food industry. Microbial production of carotenoids presents a stable, efficient, and environmentally friendly approach to carotenoid synthesis, prioritizing human health and sustainability. Additionally, microbial synthesis offers a broad spectrum of color options. To this end, four unexplored Rhodosporidium strains were initially evaluated for their ability to grow and synthesize carotenoids while assimilating various carbon sources. More specifically, the first part of this thesis investigates the ability of two Rhodosporidium kratochvilovae isolates (Y-42 and Y-43) to produce carotenoids under different experimental conditions, such as carbon source and carbon-to-nitrogen (C/N) ratio. Among the tested conditions, glucose and a glucose-galactose mixture proved to be the most promising substrates not only for carotenogenesis but also for the synthesis of microbial oil, another valuable metabolite. Carotenoid synthesis was highly affected by C/N ratio in both strains, while a competitive trend with microbial oil accumulation was also observed. HPLC-DAD analysis of the obtained carotenoid extracts indicated that the main molecule was β-carotene (55-85%) regardless the fermentation conditions or the strain-employed. The fermentation efficiency on glucose: galactose mixtures led to their replacement with hydrolyzed cheese whey permeate (CWP), as an alternative carbon source. Prior to fermentation, CWP was hydrolyzed either with commercial β-galactosidase or with a crude enzyme consortium. When CWP was hydrolyzed with β-galactosidase, strains Rhodosporidium kratochvilovae Y-42 and Y-43 were able to produce 1.87 and 1.64 mg/L of total carotenoids, respectively, while a microbial oil content of 19.7% and 23.9% (w/w) was also obtained. HPLC-DAD analysis of the chemical profile indicated that β-carotene was the predominant carotenoid. Conversely, when CWP hydrolysis was carried out with crude enzyme consortia using fermented wheat bran, which also served as source of free amino nitrogen (FAN), both yeasts synthesized almost solely lycopene, and at the same time low levels of microbial oil were accumulated. To further elucidate the metabolic behavior of each strain, lycopene production was investigated under different C/FAN ratios and incubation temperatures. Under the optimized culture conditions (C/FAN 40 and 33°C) yeast strain Y-42 produced 36.4 mg/L carotenoids, composed of more than 97% of lycopene, highlighting the substantial role of fermentation media in carotenoids synthesis and composition. Moreover, the lycopene-rich carotenoid extract exhibited antioxidant activity (IC50 equal to 0.89 mg/mL), signifying also the possibility to be further utilized as a functional additive in novel food formulations. Another set of experiments was then carried out investigating the unexplored marine yeasts Rhodosporidium paludigenum 2663 and 2664 on different carbon sources (glucose, fructose, sucrose, mixture of glucose-galactose). Strain 2663 produced the highest titer of total carotenoids (2.21 mg/L) when cultivated on sucrose, together with 4 g/L microbial oil (30% w/w content). Exopolysaccharides (EPS) production was also detected when sucrose was used as the sole carbon source. In the case of strain 2664, glucose favored the production of carotenoids, reaching a value of 2.93 mg/L along with 1.57 g/L microbial oil (31.8% w/w content). Bioreactor fermentations were subsequently carried out using Rhodosporidium paludigenum 2663 either with sucrose or molasses as substrate to elucidate the feasibility of producing multiple metabolites. The fed-batch strategy with molasses yielded to the highest concentrations of all metabolites, with a carotenoid titer of 3.3 mg/L, microbial oil content of 50.7% w/w (10.9 g/L), and an EPS concentration of 3 g/L. Analysis of the carotenoids chemical profile during fermentation revealed that β-carotene was the predominant carotenoid. On the other hand, oleic acid was the main fatty acid in the produced microbial oil. The obtained carotenoid extracts exhibited antioxidant (IC50 0.14 mg/mL) and antimicrobial activity, against common bacterial and fungal pathogenic strains. The recovery of microbial oil and carotenoids produced by the yeast strain Rhodosporidium paludigenum 2663 was also evaluated using supercritical CO2 extraction (SFE-CO2), an environmentally friendly technique. Yeast biomass was subjected to six different cell disruption methods prior to SFE-CO2 in order to assess the optimal pretreatment method. High speed homogenization emerged as the optimal pretreatment method, which when coupled with SFE-CO2, resulted in an 80% recovery yield of total carotenoids and an 83% recovery yield of microbial oil. The use of ethanol as co-solvent was imperative for the efficient extraction of both metabolites. Finally, potential applications of the produced carotenoid-rich microbial oil were unraveled by employing two different processes, namely electrospinning and oleogelation. Regarding encapsulation using electrospinning, the choice of encapsulation matrix significantly influenced the encapsulation efficiency (EE) of both carotenoids and microbial oil. The highest EE, 71.15% for microbial oil and 42.20% for carotenoids, were achieved when the EPS fraction was employed as a natural surfactant and incorporated in the encapsulating matrix. Regarding the oleogel-encapsulated microbial oil, a gradual degradation of carotenoids was observed during the oleogelation process. Ultimately, the oleogel retained 45% of the initial carotenoid concentration. Thermal stability of oleogels was investigated in the range of 50-90 °C targeting to assess the oil oxidation stability and carotenoids degradation. Thermal kinetics revealed that oil oxidation rate and carotenoids degradation rate were significantly lower in the oleogel-encapsulated microbial oil compared to the non-encapsulated oil. This proved that the oleogel served as a protective carrier for microbial oil and carotenoids under thermal processing conditions. Additionally, the physical properties of the oleogel showed that the oleogel had strong gel properties and good spreadability, supporting its potential for use in novel food formulations.

Η παρούσα διατριβή εστιάζει στην παραγωγή μικροβιακών καροτενοειδών με τη χρήση νέων στελεχών ζυμών, σε συνδυασμό με αποτελεσματικές και φιλικές προς το περιβάλλον μεθόδους ανάκτησης, στοχεύοντας σε εφαρμογές υψηλής προστιθέμενης αξίας σε τρόφιμα αλλά και σε φαρμακευτικά προϊόντα. Τα καροτενοειδή είναι βιοδραστικές ενώσεις γνωστές για το ευρύ φάσμα χρωμάτων αλλά και για τις ευεργετικές βιολογικές τους ιδιότητες, γεγονός που τα καθιστά ιδιαίτερα πολύτιμα για την ταχέως εξελισσόμενη βιομηχανία των τροφίμων. Η μικροβιακή παραγωγή καροτενοειδών παρουσιάζει μια αποτελεσματική και φιλική προς το περιβάλλον προσέγγιση για τη σύνθεσή τους, δίνοντας προτεραιότητα στην ανθρώπινη υγεία και την περιβαλλοντική βιωσιμότητα. Επιπλέον, η μικροβιακή παραγωγή καροτενοειδών, αναλόγως της σύστασης, δύναται να προσφέρει ένα ευρύ φάσμα επιλογών χρωμάτων. Για το σκοπό αυτό, τέσσερα ελάχιστα μελετημένα στελέχη του γένους Rhodosporidium αξιολογήθηκαν αρχικά για την ικανότητά τους να αναπτύσσονται και να συνθέτουν καροτενοειδή αφομοιώνοντας διάφορες πηγές άνθρακα. Αρχικά, η έρευνα επικεντρώθηκε στη διερεύνηση της ικανότητας δύο στελεχών Rhodosporidium kratochvilovae (Y-42 και Y-43) να παράγουν καροτενοειδή υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας, όπως σε διαφορετικές πηγές άνθρακα και σε διαφορετικούς λόγους άνθρακα/αζώτου (C/N). Η γλυκόζη και το μείγμα γλυκόζης-γαλακτόζης αποδείχθηκαν τα πιο υποσχόμενα υποστρώματα για την παραγωγή καροτενοειδών αλλά και μικροβιακού λίπους. Η σύνθεση των καροτενοειδών επηρεάστηκε σε μεγάλο βαθμό από την αναλογία άνθρακα/αζώτου και στα δύο υπό μελέτη στελέχη, ενώ παρατηρήθηκε επίσης μια ανταγωνιστική τάση με τη συσσώρευση μικροβιακού ελαίου. Η ανάλυση των εκχυλισμάτων των καροτενοειδών έδειξε ότι κυρίαρχο ήταν το β-καροτένιο (55-85%), ανεξαρτήτως των συνθηκών ζύμωσης ή του στελέχους που χρησιμοποιήθηκε. Η αποτελεσματικότητα των ζυμώσεων στο μίγμα γλυκόζης: γαλακτόζης οδήγησε στην μελέτη υδρολυμένου (και αποπρωτεϊνομένου) τυρογάλακτος ως εναλλακτική πηγή άνθρακα. Πριν από τη ζύμωση, το τυρόγαλα υπέστη υδρόλυση είτε με τη χρήση εμπορικής β-γαλακτοσιδάσης είτε με τη χρήση ακατέργαστων ενζύμων. Στην περίπτωση που για την υδρόλυση χρησιμοποιήθηκε η εμπορική β-γαλακτοσιδάση, τα στελέχη Rhodosporidium kratochvilovae Y-42 και Y-43 παρήγαγαν 1,87 και 1,64 mg/L συνολικών καροτενοειδών, αντίστοιχα, με την ταυτόχρονη συσσώρευση 19,7% και 23,9% (w/w) μικροβιακού λίπους. Η ανάλυση του προφίλ των παραγόμενων καροτενοειδών έδειξε ότι το β-καροτένιο ήταν το κύριο καροτενοειδές. Αντιθέτως, όταν η υδρόλυση του τυρογάλακτος έγινε με ακατέργαστα ένζυμα από ζυμούμενο πίτουρο σιταριού, το οποίο επίσης λειτούργησε ως πηγή αζώτου (FAN), και τα δύο στελέχη παρήγαγαν σχεδόν αποκλειστικά λυκοπένιο, ενώ μειώθηκε σημαντικά η σύνθεση μικροβιακών λιπιδίων. Η παραγωγή λυκοπενίου διερευνήθηκε περαιτέρω υπό διαφορετικές αναλογίες άνθρακα/αζώτου και θερμοκρασίες επώασης. Υπό τις βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας (λόγος άνθρακα/αζώτου 40 και 33°C), το στέλεχος Y-42 παρήγαγε 36,4 mg/L καροτενοειδών, με το 97% να είναι λυκοπένιο, αναδεικνύοντας τον καθοριστικό ρόλο του υποστρώματος στη σύνθεση και σύσταση των καροτενοειδών. Επιπλέον, το εκχύλισμα καροτενοειδών παρουσίαζε υψηλή αντιοξειδωτική δράση, υποδεικνύοντας τη δυνατότητα περαιτέρω χρήσης του ως πρόσθετου σε καινοτόμα τρόφιμα. Επιπρόσθετα, δύο νέα στελέχη ζυμομυκήτων, τα Rhodosporidium paludigenum 2663 και 2664, μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές πηγές άνθρακα (γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη, μείγμα γλυκόζης-γαλακτόζης). Το στέλεχος 2663 παρήγαγε τη μεγαλύτερη συγκέντρωση καροτενοειδών (2,21 mg/L) όταν αναπτύχθηκε σε σακχαρόζη, ενώ παράλληλα παρήγαγε και 4 g/L μικροβιακού ελαίου (30%, w/w). Μάλιστα, το ίδιο στέλεχος ήταν ικανό να παράγει και εξωπολυσακχαρίτες, όταν χρησιμοποιήθηκε η σακχαρόζη ως πηγή άνθρακα. Στην περίπτωση του στελέχους 2664, η γλυκόζη ευνόησε την παραγωγή καροτενοειδών επιτυγχάνοντας συγκεντρώσεις της τάξεως των 2,93 mg/L μαζί με 1,57 g/L μικροβιακού ελαίου (31,8%, w/w). Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα χρησιμοποιώντας είτε σακχαρόζη είτε μελάσα με το στέλεχος 2663, για την περαιτέρω διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής των εν λόγω μεταβολιτών. Η στρατηγική καλλιέργειας ημι-συνεχούς λειτουργίας με μελάσα ως υπόστρωμα οδήγησε στην παραγωγή των υψηλότερων συγκεντρώσεων όλων των μεταβολιτών, με τα καροτενοειδή να ανέρχονται στα 3,3 mg/L, ενώ η περιεκτικότητα σε μικροβιακό έλαιο έφθασε στο 50,7% (w/w), και η συγκέντρωση των εξωπολυσακχαριτών στα 3 g/L. Η ανάλυση του προφίλ των καροτενοειδών έδειξε ότι το β-καροτένιο ήταν το κύριο καροτενοειδές, ενώ το ελαϊκό οξύ ήταν το κύριο λιπαρό οξύ του παραγόμενου μικροβιακού ελαίου. Τα εκχυλίσματα καροτενοειδών που προέκυψαν έδειξαν υψηλή αντιοξειδωτική δράση, καθώς επίσης και αντιμικροβιακή δράση έναντι κοινών βακτηριακών και μυκητιακών παθογόνων στελεχών. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η ανάκτηση του μικροβιακού ελαίου και των καροτενοειδών από το στέλεχος Rhodosporidium paludigenum 2663 χρησιμοποιώντας εκχύλιση με υπερκρίσιμο CO2 (SFE-CO2), μια μέθοδο φιλική προς το περιβάλλον. Πριν από την εκχύλιση, η βιομάζα υποβλήθηκε αρχικά σε έξι διαφορετικές μεθόδους διάρρηξης των κυττάρων, με την ομογενοποίηση υψηλών ταχυτήτων να αναδεικνύεται ως η βέλτιστη μέθοδος προ-επεξεργασίας, η οποία σε συνδυασμό με τη μέθοδο (SFE-CO2), οδήγησε σε αποδόσεις ανάκτησης των καροτενοειδών της τάξεως του 80% και σε ανάκτηση 83% του μικροβιακού ελαίου. Η χρήση αιθανόλης ως συν-διαλύτη ήταν καθοριστικής σημασίας για την αποδοτική ανάκτηση και των δύο μεταβολικών προϊόντων. Στο τελευταίο στάδιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής εξετάστηκαν πιθανές εφαρμογές του πλούσιου σε καροτενοειδή μικροβιακού ελαίου, μέσω της αξιολόγησης δύο μεθόδων ενθυλάκωσης: της ηλεκτρονηματοποίησης και των ελαιοπηκτών. Όσον αφορά τη διαδικασία ηλεκτρονηματοποίησης, η επιλογή των συστατικών της μήτρας ενθυλάκωσης επηρέασε σημαντικά την αποδοτικότητά της ενθυλάκωσης. Οι μεγαλύτερες αποδόσεις ενθυλάκωσης για το μικροβιακό έλαιο και τα καροτενοειδή ήταν 71,15% και 42,20%, αντίστοιχα, όταν χρησιμοποιήθηκαν οι εξωπολυσακχαρίτες στη μήτρα ενθυλάκωσης. Όσον αφορά την ελαιοπηκτή που αναπτύχθηκε με το μικροβιακό έλαιο, παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση της περιεκτικότητας σε καροτενοειδή κατά τη διαδικασία της παραγωγής της ελαιοπηκτής, η οποία τελικά διατήρησε το 45% της αρχικής συγκέντρωσης των καροτενοειδών. Η μελέτη της θερμικής σταθερότητας του μικροβιακού ελαίου και των καροτενοειδών διερευνήθηκε στην περιοχή 50-90 °C, με στόχο την αξιολόγηση της σταθερότητάς τους. Η εφαρμογή κινητικών μοντέλων έδειξε ότι οι ρυθμοί οξείδωσης του ελαίου και αποικοδόμησης των καροτενοειδών ήταν σημαντικά χαμηλότεροι στην ελαιοπηκτή σε σύγκριση με το μη ενθυλακωμένο μικροβιακό έλαιο. Ως εκ τούτου, η ελαιοπηκτή λειτούργησε ως προστατευτικός φορέας τόσο του μικροβιακού ελαίου όσο και των καροτενοειδών υπό συνθήκες θερμικής επεξεργασίας. Επιπλέον, η ανάλυση των φυσικών ιδιοτήτων ανέδειξε την υψηλή ικανότητα επάλειψης και την υψηλή μηχανική αντοχή της ελαιοπηκτής, υποστηρίζοντας περαιτέρω την δυνατότητα εφαρμογής της για την ανάπτυξη καινοτόμων προϊόντων τροφίμων.