Physiology of tuber development and stolon architecture

Abstract

Potato (Solanum tuberosum) is one of the most important crop plants. It has great nutritional value for man and is used in industry in a wide variety of applications. Among agricultural commodities, potato is ranked 7th with a value of over 44 billion dollars at a worldwide scale. The edible part of the potato plant is the potato tuber that grows at the tips of etiolated shoots, called stolons. Study of the physiology of tuber initiation revealed a role for gibberellins(GAs) in tuber initiation. GA degradation genes are up-regulated prior to visible swelling and and GA levels decrease rapidly at the early stages of tuber induction. A more detailed investigation of the expression pattern of genes during early stages of tuber development with the use of a microarray chip, provided new insight on the phytohormone related genes involved in tuber initiation and development. Several auxin related genes exhibited a differential expression pattern, indicating that auxin might be involved in tuber organogenesis. Auxin is one of the most important and well studied phytohormones, with a role in many developmental events, such as embryo patterning, shoot branching and adventitious root formation. In several of these occasions, auxin mediated changes of the plane of cell division is an important feature to achieve organ development. In this thesis we try to elucidate the role of auxin and its branching counterpart, Strigolactones (SLs) in tuber initiation and development. In addition, we study the physiological mechanisms that regulate stolon branching, and the effect of changes in the branching mechanism on tuber numbers and tuber yield. Furthermore, we study the effect of altered G A content on stolon branching and tuber development and yield. In chapter one, we discuss the importance of the potato crop and introduce auxin, SLs and GAs, the biosynthesis pathways and their respective roles in plant development. In addition, we discuss the mechanisms that mediate shoot branching and the factors that regulate tuber initiation. In chapter two, we used several different approaches to investigate the role of auxin in tuber initiation and development. Auxin applications inhibited in vitro tuber initiation when IAA was renewed in the medium. On the other hand, when a pulse of auxin was provided to the invitro explants, the rate of tuberisation was increased. Measurements of the auxin content in in vivo stolon tips revealed that auxin content peaked just prior to tuber swelling. In addition, expression studies of auxin biosynthesis genes showed that at least one YUC-like gene that is likely to be involved in auxin biosynthesis, has a peak in expression prior to the increase in IAA content. Radiolabeled IAA transport assays indicated that auxin is polarly transported from the stolon tip to the basal part of the stolon. This finding indicates auxin is synthesized in the stolon tip. Furthermore, application of SLs in the in vitro tuberisation system strongly inhibited tuberisation, and measurements of strigolactone content in in vivo plants revealed that potato plants are able to produce SLs. Taken together, this data highlight a role for auxin in tuber development, and helped us to describe a mechanism for stolon branching analogous to the control of above ground shoot branching .An earlier microarray chip experiment on potato tuber developmental stages had revealed that at least two PIN-like genes had a peak in expression during early stages of tuber development. In chapter three, we identify ten members of the PIN family of genes in potato based onPage114sequence similarity with known PIN genes. Using the RNA-seq data generated within the potato sequencing project, we investigate the expression pattern of the PIN family in various tissues in potato. Using the tuber developmental stages as described in chapter two, we investigated the expression pattern of the PIN gene family during the early stages of tuber development. We cloned the promoter regions of StPINV and StPINVII, and used them in promoter driven GUS constructs in order to visualise the locations of expression of those two PIN genes in various tissues of the potato plant such as flowers, roots and swelling stolon tips. Finally, we combine the results of chapters two and three to discuss the role of auxin distribution in tuber initiation and development. GAs is a group of phytohormones that is known be involved in tuber initiation. In chapter four, we report the cloning of StGA3ox2 and the use of this gene in an RNAi construct to silence its expression in potato. StGA3ox2 is known to be involved in the degradation of active GAs into inactive forms. StGA3ox2 RNAi plants exhibited shorted shoot length, smaller leaf size and smaller average tuber weight, due to increased number of tubers per plant. The content of several GAs was determined as well as the expression of GA biosynthesis and degradation genes in the transgenic clones and reveals changed metabolic fluxes of GA pathways due to the silencing of StGA30x2 expression. Finally, we discuss our results with respect to the current literature on the role of GA in tuber initiation stolon architecture and tuber development. In chapter five, we investigated the role of StYUC-like1 gene in tuber initiation and development. StYUC-like1 was identified to have a peak in expression during tuber induction and prior to tuber swelling in the tuber developmental stages from chapter two. StYUC-like1was cloned into a CaMV35S over-expression vector and transformed into potato plants. The transformed clones exhibited enhanced shoot and stolon branching, enhanced lateral root formation and decreased average tuber weight due to increased number of tubers per plant. In addition, one of the transgenic clones exhibited a cracked tuber phenotype. Measurements of the IAA content in the transgenic clones revealed that the transgenic clones had less auxin in the basal stem, providing explanation for the phenotype observed that are consistent with the lower auxin content phenotypes. Furthermore, we discuss the role of auxin biosynthesis in stolon branching and how it impacts on the number of tubers that are produced. In chapter six, we summarise the most important results of this thesis. We discuss the role of auxin in tuber development based on the auxin content peak and the possible interaction with GA to regulate tuber initiation and growth. In addition, we portray an auxin mediated model, similar to the one that is present in shoots, that controls stolon branching. Furthermore, the effect of altered GA and IAA content on the number of tubers and tuber yield is discussed. Finally, we present the future prospects of the work on tuber initiation and development research as well as from an agronomic point of view.

Η πατάτα (Solanum tuberosum) αποτελεί ένα από τις πιο σημαντικές καλλιέργειες. Έχει μεγάλη διατροφική αξία για τον άνθρωπο και χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία για διάφορες εφαρμογές. Ανάμεσα στα αγροτικά προϊόντα, η πατάτα κατατάσσεται στην 7η θέση με παγκόσμια αξία που ξεπερνά τα 44 δισεκατομμύρια δολάρια. Το βρώσιμο μέρος της πατάτας είναι ο κόνδυλος που αναπτύσσεται στις άκρες των ξεθωριασμένων βλαστών, οι οποίοι ονομάζονται столоνοι (stolons). Μελέτες της φυσιολογίας της έναρξης της ανάπτυξης των κονδύλων αποκάλυψαν το ρόλο των γιββερελλινών (GAs) σε αυτή τη διαδικασία. Τα γονίδια αποδόμησης των GAs αυξάνονται σε έκφραση πριν από το ορατό πρήξιμο και τα επίπεδα GA μειώνονται γρήγορα στα αρχικά στάδια της επαγωγής των κονδύλων. Μια πιο λεπτομερής διερεύνηση του προτύπου έκφρασης των γονιδίων κατά τα αρχικά στάδια της ανάπτυξης των κονδύλων με χρήση ενός microarray chip, παρείχε νέες γνώσεις σχετικά με τα γονίδια που σχετίζονται με τις φυτοορμόνες και εμπλέκονται στην έναρξη και την ανάπτυξη των κονδύλων. Αρκετά γονίδια που σχετίζονται με τις αυξίνες έδειξαν διαφορετικό μοτίβο έκφρασης, υποδεικνύοντας ότι οι αυξίνες μπορεί να εμπλέκονται στην οργανογένεση των κονδύλων.Η αυξίνη είναι μια από τις πιο σημαντικές και καλά μελετημένες φυτοορμόνες, με ρόλο σε πολλά αναπτυξιακά γεγονότα, όπως ο σχηματισμός εμβρύων των σπόρων, η διακλάδωση των βλαστών και ο σχηματισμός δευτερευόντων ριζών. Σε πολλές από αυτές τις περιπτώσεις, οι αλλαγές στον άξονα διαίρεσης των κυττάρων που μεσολαβούνται από τις αυξίνες αποτελούν ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για την ανάπτυξη των οργάνων. Σε αυτή τη διατριβή προσπαθούμε να διαλευκανθεί ο ρόλος της αυξίνης και του συνέταιρού της στη διακλάδωση, των στριγολακτονών (SLs), στην έναρξη και την ανάπτυξη των κονδύλων. Επιπλέον, μελετάμε τους φυσιολογικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν τη διακλάδωση των στολώνων και την επίδραση των αλλαγών στον μηχανισμό διακλάδωσης στον αριθμό και την απόδοση των κονδύλων. Επιπλέον, μελετάμε την επίδραση της αλλαγής του περιεχομένου σε GA στη διακλάδωση των στολών, την ανάπτυξη των κονδύλων και την απόδοση. Στο πρώτο κεφάλαιο, συζητάμε τη σημασία της καλλιέργειας της πατάτας και εισάγουμε τις αυξίνες, τις SLs και τις GAs, τις οδούς βιοσύνθεσης τους και τους αντίστοιχους ρόλους τους στην ανάπτυξη των φυτών. Επιπλέον, συζητάμε τους μηχανισμούς που μεσολαβούν στη διακλάδωση των βλαστών και τους παράγοντες που ρυθμίζουν την έναρξη της ανάπτυξης των κονδύλων. Στο δεύτερο κεφάλαιο, χρησιμοποιήσαμε διάφορες προσεγγίσεις για να διερευνήσουμε το ρόλο της αυξίνης στην έναρξη και την ανάπτυξη των κονδύλων. Οι εφαρμογές αυξίνης αναστέλλουν την έναρξη της ανάπτυξης κονδύλων in vitro όταν η IAA ανανεώνεται στο μέσο καλλιέργειας. Από την άλλη πλευρά, όταν παρέχεται μια δόση αυξίνης στα in vitro εκφυλίσματα, ο ρυθμός κονδυλοποίησης αυξάνεται. Μετρήσεις του περιεχομένου αυξίνης στις άκρες των στολών in vivo αποκάλυψαν ότι το περιεχόμενο αυξίνης κορυφώνεται λίγο πριν από το πρήξιμο του κονδύλου. Επιπλέον, μελέτες έκφρασης γονιδίων βιοσύνθεσης αυξίνης έδειξαν ότι τουλάχιστον ένα γονίδιο τύπου YUC, το οποίο πιθανώς εμπλέκεται στη βιοσύνθεση αυξίνης, έχει ένα πίκο έκφρασης πριν από την αύξηση του περιεχομένου IAA. Δοκιμές μεταφοράς ραδιενεργού IAA έδειξαν ότι η αυξίνη μεταφέρεται πολικά από την άκρη του στολόνου στο βασικό τμήμα του. Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι η αυξίνη συντίθεται στην άκρη του στολόνου. Επιπλέον, η εφαρμογή SLs στο σύστημα κονδυλοποίησης in vitro ανέστειλε έντονα την κονδυλοποίηση, και οι μετρήσεις του περιεχομένου στριγολακτονών σε in vivo φυτά αποκάλυψαν ότι τα φυτά πατάτας είναι ικανά να παράγουν SLs. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν έναν ρόλο για την αυξίνη στην ανάπτυξη των κονδύλων και μας βοήθησαν να περιγράψουμε έναν μηχανισμό για τη διακλάδωση των στολών ανάλογο με τον έλεγχο της διακλάδωσης των υπέργειων βλαστών.Ένα προηγούμενο πείραμα με τσιπ μικροσυστοιχιών σε στάδια ανάπτυξης κονδύλων πατάτας είχε αποκαλύψει ότι τουλάχιστον δύο γονίδια τύπου PIN είχαν μια αυξηση της έκφρασης στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του κονδύλου. Στο κεφάλαιο τρία, ταυτοποιούμε δέκα μέλη της οικογένειας γονιδίων PIN στην πατάτα βάσει ομοιότητας αλληλουχίας με γνωστά γονίδια PIN. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα RNA-seq που δημιουργήθηκαν εντός του έργου αλληλούχισης της πατάτας, διερευνούμε το πρότυπο έκφρασης της οικογένειας PIN σε διάφορους ιστούς της πατάτας. Χρησιμοποιώντας τα στάδια ανάπτυξης του κονδύλου όπως περιγράφονται στο κεφάλαιο δύο, διερευνήσαμε το πρότυπο έκφρασης της οικογένειας γονιδίων PIN στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του κονδύλου. Κλωνοποιήσαμε τις περιοχές προαγωγέα των StPINV και StPINVII και τις χρησιμοποιήσαμε σε κατασκευάσματα GUS που οδηγούνται από προαγωγέα, προκειμένου να απεικονίσουμε τις θέσεις έκφρασης αυτών των δύο γονιδίων PIN σε διάφορους ιστούς του φυτού της πατάτας, όπως άνθη, ρίζες και πρησμένες άκρες στολών. Τέλος, συνδυάζουμε τα αποτελέσματα των κεφαλαίων δύο και τρία για να συζητήσουμε το ρόλο της κατανομής της αυξίνης στην έναρξη και την ανάπτυξη του κονδύλου.Οι γιββερελλίνες (GAs) είναι μια ομάδα φυτοορμονών γνωστών για την εμπλοκή τους στην έναρξη της ανάπτυξης των κονδύλων. Στο κεφάλαιο τέσσερα, αναφέρουμε την κλωνοποίηση του StGA3ox2 και τη χρήση αυτού του γονιδίου σε κατασκευή RNAi για την αποσιώπηση της έκφρασής του στην πατάτα. Το StGA3ox2 είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην αποικοδόμηση των ενεργών μορφών των GAs σε ανενεργές. Τα φυτά StGA3ox2 RNAi παρουσίασαν μικρότερο μήκος βλαστών, μικρότερο μέγεθος φύλλων και μικρότερο μέσο βάρος κονδύλων, λόγω του αυξημένου αριθμού κονδύλων ανά φυτό. Προσδιορίστηκε επίσης το περιεχόμενο διαφόρων GAs, καθώς και η έκφραση των γονιδίων βιοσύνθεσης και αποικοδόμησης GA στους τροποποιημένους κλώνους, αποκαλύπτοντας αλλαγές στις μεταβολικές ροές των οδών GA λόγω της αποσιώπησης της έκφρασης του StGA30x2. Τέλος, συζητάμε τα αποτελέσματά μας σε σχέση με την υπάρχουσα βιβλιογραφία σχετικά με το ρόλο των GA στην έναρξη της ανάπτυξης των κονδύλων, τη δομή των στολών και την ανάπτυξη των κονδύλων. Στο κεφάλαιο πέντε, διερευνήσαμε το ρόλο του γονιδίου StYUC-like1 στην έναρξη και την ανάπτυξη των κονδύλων. Το StYUC-like1 διαπιστώθηκε ότι έχει μια κορύφωση της έκφρασης κατά την επαγωγή του κονδύλου και πριν από το πρήξιμο του κονδύλου στα στάδια ανάπτυξης του κονδύλου από το κεφάλαιο δύο. Το StYUC-like1 κλωνοποιήθηκε σε φορέα υπερέκφρασης CaMV35S και μετασχηματίστηκε σε φυτά πατάτας. Οι μετασχηματισμένοι κλώνοι παρουσίασαν αυξημένη διακλάδωση βλαστών και στολώνων, αυξημένο σχηματισμό πλευρικών ριζών και μειωμένο μέσο βάρος κονδύλων λόγω του αυξημένου αριθμού κονδύλων ανά φυτό. Επιπλέον, ένας από τους μετασχηματισμένους κλώνους παρουσίασε φαινότυπο σχισμένου κονδύλου. Οι μετρήσεις του περιεχομένου IAA στους μετασχηματισμένους κλώνους αποκάλυψαν ότι οι μετασχηματισμένοι κλώνοι είχαν λιγότερη αυξίνη στο βασικό στέλεχος, παρέχοντας εξήγηση για τον παρατηρούμενο φαινότυπο που είναι συνεπής με τους φαινοτύπους με χαμηλότερο περιεχόμενο αυξίνης. Επιπλέον, συζητάμε το ρόλο της βιοσύνθεσης της αυξίνης στη διακλάδωση των στολών και τον τρόπο με τον οποίο επηρεάζει τον αριθμό των κονδύλων που παράγονται.Στο κεφάλαιο έξι, συνοψίζουμε τα σημαντικότερα αποτελέσματα αυτής της διατριβής. Συζητάμε το ρόλο της αυξίνης στην ανάπτυξη του κονδύλου με βάση την κορύφωση του περιεχομένου αυξίνης και τη πιθανή αλληλεπίδραση με τα GA για τη ρύθμιση της έναρξης και της ανάπτυξης του κονδύλου. Επιπλέον, απεικονίζουμε ένα μοντέλο μεσολαβούμενο από την αυξίνη, παρόμοιο με αυτό που υπάρχει στους βλαστούς, το οποίο ελέγχει τη διακλάδωση των στολών. Επιπλέον, συζητάται η επίδραση της τροποποιημένης περιεκτικότητας σε GA και IAA στον αριθμό των κονδύλων και στην απόδοση των κονδύλων. Τέλος, παρουσιάζουμε τις μελλοντικές προοπτικές της έρευνας σχετικά με την έναρξη και την ανάπτυξη του κονδύλου, καθώς και από αγρονομική άποψη.

Aardappel (Solanum tuberosum) is een van de belangrijkste landbouwgewassen wereldwijd (rang 7) met een economische waarde van meer dan 44 miljard dollar. Het heeft een hoge voedingswaarde voor de mens alsook een grote verscheidenheid aan industriele toepassingen. Het eetbare deel van de aardappelplant is de knol die groeit op de toppen van geëtioleerde scheuten, de zogenaamde stolonen. In eerdere studies naar de gebeurtenissen voorafgaand en tijdens aardappelknolinitiatie werd al snel een centrale rol voor het plantenhormoon Gibberelline (GA) gevonden. GA degradatie genen worden al op-gereguleerd nog voordat de eerst stolon zwellingen zichtbaar zijn, met als gevolg dat GA niveaus snel afnemen tijdens de eerste stadia van knolvorming. Een meer gedetailleerd onderzoek naar de expressie van genen tijdens de eerste stadia van knolontwikkeling met behulp van een microarray, resulteerde in nieuwe inzichten met betrekking tot hormoon gerelateerde genexpressie. Naast GA genen werden ook verschillende auxine (IAA) gerelateerde genen geidentificeerd met differentiële expressie tijdens knolvorming. Dit resulteerde in de aanname dat er ook een regulerende rol voor auxine is weggelegd tijdens aardappelknolvorming. Auxine is een van de belangrijkste en best bestudeerde fytohormonen, met een rol in veel ontwikkelingsgebeurtenissen zoals embryo ontwikkeling, stengelvertakkingen en adventieve wortelvorming. In een aantal van deze processen is een verandering van de orientatie van celdeling een belangrijk kenmerk waarin auxine een belangrijke rol lijkt te spelen. In dit proefschrift proberen we de rol voor auxine en zijn tegenhanger m.b.t stengelvertakkingen, strigolactonen (SLs) in de regulatie van knol initiatie te ontrafelen. Daarnaast bestuderen we de fysiologie van stolonvertakkingen, en het effect van veranderingen in stolonvertakking op knol aantallen en opbrengst. Ook doen we onderzoek naar de invloed van veranderde GA concentraties op stolonen vertakking, knolontwikkeling en opbrengst. In hoofdstuk 1 bespreken we het belang van de aardappel als voedings gewas en beschrijven we de factoren van belang voor aardappelknol inductie. Daarnaast introduceren we de biosynthese routes van de planten hormonen auxine, SL en GA en hun functies in relatie tot plant ontwikkeling. Ook wordt het mechanisme van stengelvertakkingen besproken met de focus op bovengenoemde planten hormonen. In hoofdstuk 2 gebruiken we verschillende onderzoeksmethoden om de rol van auxine te begrijpen tijdens het proces van knolinitiatie en ontwikkeling. Applicatie van auxine (IAA) aan het medium remt in vitro knol inductie als de auxine in het medium op tijd wordt ververst. Anderzijds, wanneer een enkele puls van auxine aan in vitro explantaten word gegeven, lijdt dit uiteindelijk tot een versterkte knolintiatie phenotype. Uit metingen van de auxine concentratie in de stolon tips bleek dat auxine piekt vlak voor stolonzwelling. Expressie studies van auxine biosynthese genen toonde aan dat ten minste een van de YUCachtige genen, betrokken bij de biosynthese van auxine, een piek in expressie heeft nog voor de piek in auxine concentratie. Met radioactief gelabeld IAA wordt aangetoond dat auxine polair wordt getransporteerd van de stolon tip naar het basale deel van de stolonen. Op basis van dit resultaat kan worden geconcludeerd dat auxine in de stolon tip wordt geproduceerd. De applicatie van Strigolactones (SL) in het in vitro tuberisation systeem resulteerde in een sterke inhibitie van knolzetting en via metingen van de strigolactone concentratie in in vivo planten wordt voor het eerst aangetoond dat aardappelplanten strigolactones kunnen produceren. Al deze gevens tesamen tonen een rol voor auxine in knol ontwikkeling, alsook een rol in stolonvertakkingen opeenzelfde manier zoals beschreven in bonvengrondse stengels. Uit een eerdere microarray experiment met verschillenden aardappel ontwikkelingsstadia bleek dat ten minste twee PIN-achtige genen, betrokken bij auxin transport, een piek in expressie vertoonden tijdens de vroege stadia van knolontwikkeling. In hoofdstuk drie, beschrijven we de identificatie van tien leden van de PIN-familie van genen in aardappel op basis van sequentie-overeenkomst van beschreven PIN-genen uit andere species. Met behulp van de RNA-seq data, gegenereerd binnen het aardappel-sequencing project , onderzoeken we het expressiepatroon van de PIN-familie in de verschillende weefsels van de aardappelplant. Ook wordt de expressie van de verschillende PIN genen gevolgd tijden verschillende knolontwikkelingsstadia. De promoters van twee pin familie leden zijn gekloneerd en localisatie van expressie in de aardappel plant is uitgevoerd via GUS reporter constructen en gevisualiseerd in verschillende weefsels van de aardappelplant zoals bloemen, wortels en stolon tips. Aan het eind van hoofdstuk 3 worden de resultaten voor auxine distributie in de aardappel besproken in relatie tot de resultaten van hoofdstuk 2. Gibbereline (GA) is een groep van fytohormonen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij knolinitiatie. In hoofdstuk vier beschrijven we de klonering van StGA3ox2 en het gebruik van dit gen in een RNAi construct om StGA3ox2 expressie te verlagen. Voor StGA3ox2 is bekend dat het betrokken is bij de afbraak van actieve GAs naar inactieve vormen. StGA3ox2 RNAi planten vertoonde verkorte stengels, kleiner blad en een lager gemiddeld knolgewicht, dit laastste met name als gevolg van toename van het aantal knollen per plant. De veranderde concentraties van GAs en de expressie van GA biosynthese en afbraak genen in de transgene klonen, laat zien hoe de GA metabole routes veranderen als gevolg van de verlaagde expressie van StGA3ox2. Tot slot bespreken we onze resultaten over de rol van GA in knolinitiatie en ontwikkeling in relatie tot de huidige literatuur. In hoofdstuk vijf onderzoeken we de rol van StYUC-like1 gen, een auxin biosynthese gen, in knol initiatie en ontwikkeling. StYUC-like1 werd geïdentificeerd met een piek in expressie tijdens knolinitiatie in de ontwikkelingsstadia zoals beschreven in hoofdstuk twee. StYUClike1 werd gekloneerd in een CaMV35S over-expressie vector en getransformeerd in aardappelplanten. De getransformeerde klonen vertoonden versterkte stengel en stolonvertakkingen en meer laterale wortelvorming alsook en een lagere gemiddelde tuber gewicht door een verhoogd aantal knollen per plant. Een van de transgene klonen vertoonde ook een interessant gebarsten knol phenotype. Uit metingen van de IAA concentratie in de transgene klonen bleek dat de transgene planten minder auxine ophoopten in het basale stengel gedeelte, wat overeenkomt met de verhoogde aantal stengel vertrakkingen in dit gedeelte van de plant. Daarnaast beschrijven we de rol van auxine biosynthese in de regulatie van stolonen vertakking en hoe dit relateerd aan het aantal knollen die worden gevormd. In hoofdstuk zes, vatten we de belangrijkste resultaten van dit proefschrift samen. We bespreken de rol van auxine bij knol ontwikkeling op basis van de auxine concentratie piek en de mogelijke interactie met GA om het proces van knol initiatie en groei te reguleren. We beschrijven een model voor stolon vertakkingen overeenkomstig met het model zoals beschreven voor bovengrondse stengelvertakkingen met een centrale rol voor auxine. Bovendien wordt het effect van gewijzigde GA en IAA inhoud op het aantal knollen en knolopbrengst besproken. Tot slot presenteren we de onderzoeks mogelijkheden op het gebied van knol initiatie en ontwikkeling vanuit een landbouwkundig oogpunt.