Structural and functional relationship of high-density lipoprotein (HDL) and its role in development of atherosclerosis

Abstract

Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of mortality worldwide according to the World Health Organization (WHO) and consists of heart and blood vessel disorders such as coronary artery disease (CAD). CAD is caused by atherosclerosis, a chronic inflammatory disorder of the arterial wall, arising from an imbalance in lipid metabolism and immune responses. To date, numerous epidemiological and clinical studies have demonstrated an inverse association between the risk of developing CAD in humans and plasma high-density lipoprotein (HDL) cholesterol levels. Based on this relationship, several clinical efforts were made to decrease the CAD risk by pharmacologically increasing the HDL cholesterol levels. Nevertheless, the adverse and paradoxical findings obtained from different clinical trials, epidemiological and population studies, and genetic studies have shifted the current focus from HDL cholesterol concentration (quantity) to HDL particle functionality (quality) which incorporates many proteins and lipids with unique functions. Since the distinction between HDL cholesterol quantity and quality is crucial and reflects the beneficial pleiotropic effects of HDL, the main goal of this PhD thesis is to explore the structure-function relationship of HDL and its role in the development of atherosclerosis. In Subchapter 3.1 we studied the effect of the enzyme myeloperoxidase (MPO) on HDL structure and functionality in vivo. MPO, a leukocyte-derived peroxidase, is highly expressed during inflammation and associated with HDL by reducing its functionality and contributing to atherosclerosis. Additionally, apolipoprotein A-I (apoA-I), the primary protein component of HDL, possesses a central role in HDL biosynthesis, structure and function by interacting with a number of receptors and enzymes, including ABCA1, ABCG1, SR-BI and LCAT. The aforementioned interactions trigger the activation of atheroprotective properties of HDL such as cholesterol efflux and anti-oxidative, anti-inflammatory, anti-apoptotic and anti-thrombotic properties. Based on these, we generated recombinant adenoviruses expressing the wild type (WT) and mutant forms, Met148Ala (M148A) and Tyr192Ala (Y192A), of human apoA-I and human MPO and analyzed them in apoA-I -/- mice. Following injection of adenoviruses, we found that mice with overexpressed MPO had considerably higher plasma apoA-I and HDL levels without affecting the expression of genes related to the liver's HDL synthesis or catabolism. Next, we further examined the effect of overexpressed MPO in the liver of apoA-I -/- mice by analyzing the mRNA levels of pro- and anti-inflammatory cytokines using the RT-qPCR method. As a result, MPO overexpression reduced the expression of pro-inflammatory genes and increased or did not affect the expression of anti-inflammatory genes suggesting that MPO had no toxic effects in the liver. Moreover, we investigated the effect of WT or mutant apoA-I forms and MPO on generated HDL particles by performing two-dimensional electrophoresis (2D-PAGGE) and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). In the plasma of mice overexpressing MPO, no significant alterations in HDL size or electrophoretic mobility was observed with the exception of mice expressing apoA-I (M148A) which showed enriched pre-b relative to alpha (α) HDL particles, suggesting that the apoA-I (M148A) mutation may interfere with HDL remodeling. Finally, we showed that overexpression of MPO was associated with reduced anti-oxidant capacity of HDL particles in all mice. Interestingly, HDL particles bearing apoA-I (Y192A) showed enhanced ABCA1 dependent cholesterol efflux from macrophages which was not affected by MPO and these mice had reduced levels of LDL cholesterol. The study discussed in Subchapter 3.2 was performed in collaboration with Dr. Despina Sanoudou’s laboratory in Medical School of Athens and our specific contribution was the exploration of the atheroprotective potential of reconstituted HDL (rHDL) containing human apolipoprotein E3 (apoE3), the most common variant of the polymorphic apoE, in vivo. In particular, we conducted an in vivo study using a well-established mouse model of hypercholesterolemia, atherosclerosis, and endothelial dysfunction, in the apoE-/- mice in order to assess rHDL-apoE3 under pathological conditions. Following the injection of rHDL-apoE3 in apoE-/- mice, we found that a single dose led to significantly reduced plasma LDL levels accompanied by an increased concentration of cholesterol in the liver suggesting a fast clearance of LDL particles through binding of apoE to liver receptors. Moreover, serum lipid analysis at specific time points indicated that triglyceride levels were transiently increased in mice that received rHDL-apoE3 due to fast clearance of apoE from the circulation. Lastly, in order to evaluate the impact of rHDL-apoE3 on vascular permeability, we used Evans Blue dye which binds to albumin and is transferred to adjacent tissues under pathological conditions where the endothelium becomes imperable. Based on that, we explored that a single injection of rHDL-apoE3 in the tail vein of apoE-/- mice was able to improve vascular permeability as evidenced by the reduced concentration of the dye in certain tissues such as the stomach, the tongue, and the urinary bladder. Next, in Subchapter 3.3 we generated recombinant adenovirus expressing the human GALNT2 and analyzed it in apoA-I -/- mice either fed with Chow or High Fat Diet (HFD) in order to investigate the effect of human GALNT2 on lipoprotein metabolism in vivo. Human GALNT2 is a glycotransferase and is highly correlated with O-linked glycosylation, one of the most significant forms of post-translational modifications which affects protein folding, processing, secretion and functions. Changes in the glycosylation status of proteins are associated with pathological conditions such as dyslipidemia and atherosclerosis. According to our findings, the overexpression of human GALNT2 did not affect the lipid profile of HFD-fed mice but increased the total cholesterol and LDL and decreased the HDL, triglycerides, and VLDL levels in chow-fed mice. These findings suggest that the overexpression of GALNT2 modulates lipoprotein metabolism and indicates lipoprotein metabolism related proteins as modifying substrates for glycosylation. An intriguing finding of the present study was that overexpression of human GALNT2 in chow-fed mice resulted in a significant decrease in mRNA levels of the major metabolic intermediates in the pathway of intracellular cholesterol synthesis, controlled by SREBP-2 (Sterol regulatory element-binding protein 2). Whether human GALNT2 expression in trans-Golgi and ER (endoplasmic reticulum) systems affects the activation of SREBP2 directly or indirectly through post-translational modification requires further investigation. Lastly, the study discussed in Subproject 4.4 has provided the tools for further investigation of the role of specific apoA-I residues on HDL structure and functions and the prevention and treatment of atherosclerosis. Since the study of apoA-I mutations in diseases that develop over long periods, such as atherosclerosis, with adeno-mediated transfer was prohibitive, we further developed adeno-associated viral vectors that promote the long-term expression of the gene of interest in various animal models and enabled the examination of chronic diseases. For that reason, we generated, amplified and purified recombinant adeno-associated viruses expressing apoA-I wt, apoA-I [D89A/E91A/E92A], and apoA-I [L218A/L219A/V221A/L222A] for use both in vitro and in vivo studies.

Η καρδιαγγειακή νόσος είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) και αφορά σε διαταραχές της καρδιάς και των αιμοφόρων αγγείων, όπως η στεφανιαία νόσος (ΣΝ). Η ΣΝ προκαλείται από την αθηροσκλήρωση, μια χρόνια φλεγμονώδη διαταραχή του αρτηριακού τοιχώματος, που προκύπτει από μια ανισορροπία στο μεταβολισμό των λιπιδίων και τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Μέχρι σήμερα, πολυάριθμες επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του κινδύνου ανάπτυξης ΣΝ και των επιπέδων χοληστερόλης των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (High-Density Lipoprotein, HDL) στο πλάσμα. Ο παραπάνω συσχετισμός οδήγησε σε αρκετές κλινικές προσπάθειες που είχαν ως στόχο μείωση του κινδύνου ανάπτυξης ΣΝ με φαρμακολογική αύξηση των επιπέδων της HDL χοληστερόλης. Ωστόσο, τα δυσμενή και παράδοξα ευρήματα που προέκυψαν από διαφορετικές κλινικές, επιδημιολογικές, πληθυσμιακές και γενετικές μελέτες έχουν μετατοπίσει το σύγχρονο επιστημονικό ενδιαφέρον από τη συγκέντρωση (ποσότητα) της HDL χοληστερόλης στη λειτουργικότητα (ποιότητα) των σωματιδίων της HDL η οποία ενσωματώνει πολλές πρωτεΐνες και λιπίδια με μοναδικές λειτουργίες. Δεδομένου ότι η διάκριση μεταξύ της ποσότητας και της ποιότητας της HDL χοληστερόλης είναι κρίσιμη και αντανακλά τις ευεργετικές πλειοτροπικές επιδράσεις της HDL έναντι της αθηροσκλήρωσης, ο κύριος στόχος αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι να διερευνήσει τη σχέση δομής-λειτουργίας της HDL και το ρόλο της στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης. Στο Υποκεφάλαιο 3.1 μελετήσαμε την επίδραση του ενζύμου μυελοϋπεροξειδάση (myeloperoxidase, MPO) στη δομή και τη λειτουργικότητα της HDL in vivo. Η MPO, μια υπεροξειδάση που προέρχεται από τα λευκοκύτταρα, εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό κατά τη διάρκεια της φλεγμονής και συνδέεται με την HDL μειώνοντας τη λειτουργικότητά της και συμβάλλοντας στην αθηροσκλήρωση. Επιπλέον, η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (αποA-I), το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό της HDL, κατέχει κεντρικό ρόλο στη βιοσύνθεση, τη δομή και τη λειτουργία της HDL αλληλοεπιδρώντας με έναν αριθμό υποδοχέων και ενζύμων. Οι προαναφερθείσες αλληλεπιδράσεις πυροδοτούν την ενεργοποίηση των αθηροπροστατευτικών ιδιοτήτων της HDL όπως την εκροή χοληστερόλης καθώς και τις αντι-οξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντι-αποπτωτικές και αντιθρομβωτικές της ιδιότητες. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε ανασυνδυασμένους αδενοϊούς που εκφράζουν την αγρίου τύπου και τις μεταλλαγμένες μορφές, Μet148Αla (M148A) και Tyr192Αla (Y192A), της ανθρώπινης αποA-I και της ανθρώπινης MPO και τους ενέσαμε σε ποντίκια με έλλειψη στο γονίδιο της αποΑ-Ι (αποΑ-Ι-/-). Μετά την ένεση των αδενοϊών, διαπιστώσαμε ότι τα ποντίκια με υπερεκφρασμένη MPO είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα αποA-I και HDL στο πλάσμα χωρίς να επηρεάζεται η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη σύνθεση ή τον καταβολισμό της HDL στο ήπαρ. Στη συνέχεια, εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της υπερεκφρασμένης MPO στο ήπαρ ποντικών με έλλειψη στο γονίδιο της αποΑ-Ι αναλύοντας τα επίπεδα mRNA των προ- και αντι φλεγμονωδών κυτταροκοκινών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (αγγλ. qRT-PCR). Διαπιστώθηκε λοιπόν οτι η υπερέκφραση MPO μείωσε την μεταγραφική έκφραση των προ-φλεγμονωδών και αύξησε ή δεν επηρέασε την έκφραση των αντιφλεγμονωδών γονιδίων υποδηλώνοντας ότι η MPO δεν είχε τοξικές επιδράσεις στο ήπαρ. Επιπλέον, διερευνήσαμε την επίδραση της αγρίου τύπου ή μεταλλαγμένων μορφών της αποΑ-Ι και MPO στα παραγόμενα σωματίδια της HDL πραγματοποιώντας πειράματα ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων (2D electrophoresis) και χρωματογραφίας πρωτεϊνών υγρής φάσης (Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC). Στο πλάσμα των ποντικών που υπερεκφράζουν την MPO, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στο μέγεθος της HDL ή στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα με εξαίρεση τα ποντίκια που εκφράζουν την αποA-I (M148A) στα οποία παρατηρήθηκε σημαντική παρουσία pre-β HDL σωματιδίων σε σχέση με τα σωματίδια άλφα (α), υποδηλώνοντας ότι η μετάλλαξη αποΑ-Ι (M148A) μπορεί να επηρεάσει την αναδιαμόρφωση της HDL. Τέλος, δείξαμε ότι η υπερέκφραση της MPO συσχετίστηκε με μειωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα των σωματιδίων HDL σε όλα τα ποντίκια. Είναι ενδιαφέρον ότι τα σωματίδια HDL που φέρουν την μεταλλαγή αποΑ-Ι (Y192A) παρουσίασαν ενισχυμένη εκροή χοληστερόλης μέσω του μεταφορέα ABCA1 (ATP binding cassette subfamily A member 1) στα μακροφάγα, ανεξάρτητη από την παρουσία της μυελοπεροξειδάσης, και αυτά τα ποντίκια είχαν μειωμένα επίπεδα χοληστερόλης χαμηλής πυκνότητας (αγγλ. LDL). Η μελέτη που συζητήθηκε στο Yποκεφάλαιο 3.2 πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το εργαστήριο της Καθηγήτριας Φαρμακογονιδιωματικής στην Ιατρική σχολή Αθηνών, κυρίας Δέσποινας Σανούδου και η συμμετοχή του εργαστηρίου μας σε αυτή αφορούσε στη διερεύνηση του αθηροπροστατευτικού δυναμικού της ανασυσταθείσας HDL (reconstituted HDL) που περιέχει την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Ε3 (rHDL-apoE3), in vivo. Συγκεκριμένα, αξιολογήσαμε την δράση της rHDL-apoE3 υπό παθολογικές καταστάσεις. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια με απαλοιφή στο γονίδιο της αποΕ3 (αποΕ-/-), ένα καλά μελετημένο μοντέλο ποντικών με υπερχοληστερολαιμία, αθηροσκλήρωση και ενδοθηλιακή δυσλειτουργία. Μετά την ένεση rHDL-apoE3 σε ποντίκια αποΕ-/-, βρήκαμε ότι μια εφάπαξ δόση οδήγησε σε σημαντικά μειωμένα επίπεδα LDL στο πλάσμα συνοδευόμενα από αυξημένη συγκέντρωση χοληστερόλης στο ήπαρ, υποδηλώνοντας γρήγορη κάθαρση των σωματιδίων LDL μέσω δέσμευσης της αποΕ στους ηπατικούς υποδοχείς. Επιπλέον, η ανάλυση λιπιδίων του ορού σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία έδειξε ότι τα επίπεδα τριγλυκεριδίων αυξήθηκαν παροδικά σε ποντίκια που έλαβαν rHDL-apoE3 λόγω της γρήγορης κάθαρσης της αποΕ από την κυκλοφορία. Τέλος, για να αξιολογήσουμε την επίδραση της rHDL-apoE3 στην αγγειακή διαπερατότητα, χρησιμοποιήσαμε την μπλε χρωστική Evans blue, η οποία συνδέεται με τη λευκωματίνη και μεταφέρεται σε γειτονικούς ιστούς υπό παθολογικές συνθήκες όπου το ενδοθήλιο καθίσταται διαπερατό. Με βάση αυτό, διερευνήσαμε ότι μία μόνο ένεση rHDL-apoE3 στην ουραία φλέβα των αποΕ-/- ποντικών ήταν ικανή να βελτιώσει την αγγειακή διαπερατότητα, όπως αποδεικνύεται από τη μειωμένη συγκέντρωση της χρωστικής σε ορισμένους ιστούς όπως το στομάχι, η γλώσσα και η ουροδόχος κύστη. Στη συνέχεια, στο Υποκεφάλαιο 3.3 δημιουργήσαμε ανασυνδυασμένο αδενοϊό που εκφράζει την ανθρώπινη GALNT2 και την αναλύσαμε σε ποντίκια με έλλειψη στο ενδογενές γονίδιο της αποΑ-Ι, που τρέφονταν με κανονική ή πλούσια σε λιπαρά δίαιτα προκειμένου να διερευνήσουμε την επίδραση της ανθρώπινης GALNT2 στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών in vivo. Η ανθρώπινη GALNT2 είναι μια γλυκοτρανσφεράση και συσχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με την γλυκοζυλίωση, μια από τις πιο σημαντικές μορφές μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων που επηρεάζει την αναδίπλωση, την επεξεργασία, την έκκριση και τις λειτουργίες των πρωτεϊνών. Οι αλλαγές στην κατάσταση γλυκοζυλίωσης των πρωτεϊνών σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις όπως η δυσλιπιδαιμία και η αθηροσκλήρωση. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, η υπερέκφραση της ανθρώπινης GALNT2 δεν επηρέασε το λιπιδαιμικό προφίλ των ποντικών που τρέφονταν με δίαιτα πλούσια σε λιπαρά HFD, αλλά αύξησε τη συνολική χοληστερόλη και την LDL και μείωσε τα επίπεδα HDL, τριγλυκεριδίων και VLDL σε ποντίκια που τρέφονταν με κανονική τροφή. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση της GALNT2 ρυθμίζει το μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών και υποδεικνύουν πιθανές πρωτεΐνες που σχετίζονται με το μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών ως τροποποιητικά υποστρώματα για γλυκοζυλίωση. Ένα ενδιαφέρον εύρημα της παρούσας μελέτης ήταν ότι η υπερέκφραση της ανθρώπινης GALNT2 σε ποντίκια που τρέφονταν με κανονική τροφή είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στα επίπεδα mRNA των κύριων μεταβολικών ενδιάμεσων στην οδό της ενδοκυτταρικής σύνθεσης χοληστερόλης, που ελέγχεται από το SREBP-2. Το εάν η ανθρώπινη έκφραση GALNT2 σε συστήματα trans-Golgi και ER επηρεάζει την ενεργοποίηση του SREBP2 άμεσα ή έμμεσα μέσω μετα-μεταφραστικής τροποποίησης απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Τέλος, η μελέτη που συζητήθηκε στο Υποκεφάλαιο 4.4 παρείχε τα εργαλεία για περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των συγκεκριμένων καταλοίπων της αποΑ-Ι στη δομή και τις λειτουργίες της HDL και στην πρόληψη και θεραπεία της αθηροσκλήρωσης. Δεδομένου ότι η μελέτη των μεταλλάξεων αποΑ-Ι με αδενο-διαμεσολαβούμενη μεταφορά σε ασθένειες που αναπτύσσονται σε μεγάλες περιόδους, όπως η αθηροσκλήρωση, ήταν απαγορευτική, αναπτύξαμε περαιτέρω ιικούς φορείς που σχετίζονται με αδενοειδείς φορείς που προάγουν τη μακροπρόθεσμη έκφραση του γονιδίου ενδιαφέροντος σε διάφορα ζωικά μοντέλα, καθιστώντας δυνατή την εξέταση χρόνιων ασθενειών. Για το λόγο αυτό, δημιουργήσαμε, ενισχύσαμε και καθαρίσαμε ανασυνδυασμένους αδενο-συσχετισμένους ιούς που εκφράζουν της αγρίου τύπου αποΑ-Ι (apoA-I wt) και τις μεταλλαγές αποΑ-Ι(Asp89Ala/Glu91Ala/Glu92Ala) [apoA-I(D89A/E91A/E92A)] και αποΑ-Ι(Leu218Ala/Leu219Ala/Val221Ala/Leu222Ala) [apoAI(L218A/L219A/V221A/L222A)] για μελλοντική χρήση και in vitro και in vivo μελέτες.