Cryo-electron microscopy studies of native cell extracts: elucidating an active pyruvate dehydrogenase complex from Chaetomium thermophilum

Abstract

Nowadays, cryo-electron microscopy (cryo-EM) unambiguously represents a rising star among the methods available to understand the architecture of protein networks and is becoming a valuable system of methodologies for the scientific community. Until the last decade, cryo-electron microscopy was employed to understand the molecular organisation of purified to homogeneity or in situ biomolecules with significant limitations in achieved resolution. Due to the recent advances in the field, structural characterisation of large, flexible and heterogeneous complexes came into reach. A new era of studying the molecular organisation of native cell extracts tries to bridge this gap. This new approach holds a great promise in the more profound understanding of molecular signatures of ordered biological systems at high-resolutions – the molecules of life. The structurally resolved signature of the fungal fatty acid synthase (FAS) at 4.7 Å in 2017, directly from eukaryotic native cell extracts, stands among the best examples in this field, being the first one reaching close-to-atomic resolution of a highly complex biological sample. Surprisingly, higherorder binders, previously completely unknown, were observed in interaction with FAS and, even though FAS was lowly enriched (less than 50 %), finally was resolved to this resolution. Although a lysis step could introduce artifacts, cell extracts retain various functional aspects. In the case of cell extracts, in contrast to extensively purified or artificially over-expressed proteins of interest, all these higher-order biomolecular interactions, dubbed as protein communities, have higher chances of remaining in their (near-) native state. Such an approach greatly complements traditional molecular biology methods and goes hand-in-hand with the holistic understanding of molecular function. In this thesis, a great example of further establishing, optimising, systematising and combining such an approach was described. The strength of native cell extracts was demonstrated by utilising them to explore megadalton (MDa) complexes involved in pyruvate oxidation, a core metabolic reaction and intrinsic part of cellular respiration. The oxidative decarboxylation of pyruvate involves one of the most critical and key playing complexes, the giant enzymatic assembly known as Pyruvate Dehydrogenase Complex (PDHc). PDHc consists of three core complexes E1, E2/E3BP and E3 in multiple copies, converting pyruvate into acetyl-CoA, providing CO2 and NADH (H+). Acetyl-CoA may then be used in the citric acid cycle to carry out cellular respiration, thereby linking glycolysis to the citric acid cycle. Due to its heterogeneity, relatively enormous size and plasticity, the quaternary structure of PDHc has never been addressed in detail before, despite the fact that its components have been characterised in isolation. In the current work, fully assembled Chaetomium thermophilum α-keto acid dehydrogenase complexes in native cell extracts were identified. Their domain arrangements were characterised utilising proteomics, activity assays, crosslinking, electron microscopy and computational modelling. A cryo-EM structure of the PDHc core was reported and many unique and previously unknown features were revealed. Besides visualised folding and binding events -unique for the endogenous complex- an asymmetric reconstruction of a 10-MDa PDHc was illustrated. The spatial proximity of its components was described and, along with the proposed stoichiometric data (60 E2p:12 E3BP:~20 E1p:≤12 E3), suggested a minimum reaction path among component enzymes. Ultimately, the calculated trafficking distance for the lipoyl from the E1p, via E2p, to E3 is ~140 Å. In such a way, a dynamic pyruvate oxidation nanocompartment organised by core and peripheral protein species of PDHc was defined. A further understanding of PDHc and α-keto acid dehydrogenase complex structure and function can be achieved within this context. The strength of the entire approach/methodology of studying huge active complexes, dubbed as metabolons, directly from native cell extracts was proved in practice. To conclude, the fact that we move towards automation in imaging cell extracts and their intrinsic organisation, combined with the integration of molecular/cell biology approaches, gives many hopes for remarkable achievements of pronounced biotechnological and medical importance. In this direction, distinct machine learning approaches can also be applied to discover protein-protein interactions within cell extracts, augmented by experimental data. Integration of machine learning, cryo-EM and complementary structural proteomic approaches can unambiguously provide the basis for a multiscale molecular description of protein communities within native cell extracts. Eventually, such steps tackle with the biophysical characterisation of cellular function in an integrative and holistic manner.

Σήμερα η κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία (κρυο-ΗΜ) αποτελεί αναμφισβήτητα μια ανερχόμενη μέθοδο επιλογής στην κατανόηση της αρχιτεκτονικής των μοριακών συμπλόκων, των αλληλεπιδράσεων τους και των διαφορετικών στερεοδιαμορφώσεών τους σε σχεδόν ατομικό επίπεδο ανάλυσης. Μέχρι πρόσφατα, η κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία χρησιμοποιούταν για την κατανόηση της μοριακής οργάνωσης βιομορίων που είχαν απομονωθεί ομοιογενώς ή παρατηρηθεί in situ. Παρά ταύτα, τα εμπόδια προς την επίτευξη υψηλής ανάλυσης και συνεπώς λεπτομέρειας παρέμεναν. Πρόσφατα ο δομικός χαρακτηρισμός μεγάλου μεγέθους ετερογενών συμπλόκων έγινε πιο προσιτός εξαιτίας των εξελίξεων στον τομέα της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Μια νέα εποχή όπου μελετάται η μοριακή οργάνωση των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσπαθεί να γεφυρώσει το χάσμα των δύο προαναφερθέντων δομικών προσεγγίσεων: Ενώ οι μέθοδοι in situ παρατηρούν τα βιομόρια στο περιβάλλον τους, δεν είναι ικανές να τα ταυτοποιήσουν με ακρίβεια, και οι μέθοδοι ομοιογενούς απομόνωσης των βιομορίων περιγράφουν επακριβώς τα συστατικά τους, αλλά εκτός του κυτταρικού περιβάλλοντος. Η νέα αυτή εποχή, λοιπόν, της δομικής μελέτης των κυτταρικών εκχυλισμάτων, υπόσχεται τη βαθύτερη κατανόηση των «μοριακών υπογραφών» των βιολογικών συστημάτων -των μορίων της ζωής- σε υψηλή ανάλυση. Το 2017, η επίλυση της δομής της συνθετάσης των λιπαρών οξέων (FAS) στα 4.7 Å χρησιμοποιώντας ως οργανισμό μοντέλο ένα μύκητα, απευθείας από ευκαρυωτικά κυτταρικά εκχυλίσματα, συγκαταλέγεται μεταξύ των καλύτερων παραδειγμάτων σε αυτόν τον τομέα. Αποτελεί ουσιαστικά την πρώτη δομή που έφτασε σε σχεδόν ατομική ανάλυση από ένα εξαιρετικά πολύπλοκο βιολογικό δείγμα. Παραδόξως, παρατηρήθηκαν αλληλεπιδράσεις υψηλότερες από αυτή της τριτοταγούς δομικής οργάνωσης με την FAS, που ήταν προηγουμένως εντελώς άγνωστες. Στο παραπάνω δείγμα η FAS ήταν εμπλουτισμένη σε χαμηλά ποσοστά (λιγότερο από 50 %), όμως επιλύθηκε σε υψηλή ανάλυση. Παρά το γεγονός ότι κατά το στάδιο λύσης των κυττάρων για την παραγωγή των κυτταρικών εκχυλισμάτων θα μπορούσαν να δημιουργηθούν «artifacts», τα κυτταρικά εκχυλίσματα διατηρούν πολλές πτυχές και πληροφορίες της κυτταρικής λειτουργίας. Οι «πρωτεϊνικές κοινότητες» και όλες αυτές οι αλληλεπιδράσεις υψηλότερης τάξης, έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες να διατηρηθούν στην (σχεδόν) ενδοκυττάρια τους κατάσταση από ό,τι οι εκτενώς και ομοιογενώς απομονωμένες ή τεχνητά υπερεκφρασμένες μορφές τους. Μια τέτοια προσέγγιση συμπληρώνει σε μεγάλο βαθμό τις παραδοσιακές μεθόδους μοριακής βιολογίας και συμβάλλει προς την κατεύθυνση της περαιτέρω κατανόηση της μοριακής λειτουργίας. Ένα εξαιρετικό παράδειγμα επιπλέον καθιέρωσης, βελτιστοποίησης, συστηματοποίησης και συνδυασμού των παραπάνω προσεγγίσεων περιγράφεται στην παρούσα διδακτορική διατριβή. Στην παρούσα εργασία αποκαλύπτονται οι δυνατότητές των κυτταρικών εκχυλισμάτων σε σχέση με τη μελέτη μεγάλων συμπλόκων (της τάξης των MDa) που εμπλέκονται στην οξείδωση του πυροσταφυλικού. Η διαδικασία αυτή αποτελεί μια βασική μεταβολική αντίδραση και σημαντικό κομμάτι της κυτταρικής αναπνοής, στην οποία εμπλέκεται ένα γιγαντιαίο ενζυμικό σύμπλοκο γνωστό ως αφυδρογονάση του πυροσταφυλικού (PDHc). Η PDHc είναι ένα σύμπλοκο τριών βασικών λειτουργικών υπο-μονάδων (πρωτεϊνών) , των E1, E2/E3BP και E3 ενζύμων, σε πολλαπλά αντίγραφα το καθένα, που ως σκοπό έχουν τη μετατροπή του πυροσταφυλικού σε ακετυλο-συνένζυμο Α (Acetyl-CoA) παρέχοντας διοξείδιο του άνθρακα (CO2) και NADH (H+). Το ακετυλο-συνένζυμο Α μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί στον κύκλο του κιτρικού οξέος για τη διεξαγωγή της κυτταρικής αναπνοής και έτσι η PDHc συνδέει τη γλυκόλυση με τον κύκλο του κιτρικού οξέος. Όσων αφορούν στον δομικό χαρακτηρισμό της PDHc, λόγω της ετερογένειάς της, του σχετικά μεγάλου μεγέθους της, της πλαστικότητάς της, και μολονότι τα συστατικά της έχουν χαρακτηριστεί μεμονωμένα, η τεταρτοταγής δομή του πλήρους συμπλόκου δεν είχε ποτέ εξεταστεί λεπτομερώς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήθηκαν διάφορα σύμπλοκα α-κετοξικών αφυδρογονασών απευθείας από κυτταρικά εκχυλίσματα, με τη χρήση ενός θερμόφιλου οργανισμού μοντέλου που ονομάζεται Chaetomium thermophilum. Η οργάνωση των υποσυμπλόκων τους μελετήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρία μάζας, δοκιμασίες ενζυμικής ενεργότητας, ηλεκτρονική μικροσκοπία και υπολογιστικά μοντέλα. Η δομή του πυρήνα της PDHc με τη χρήση κρυο-ΗM παρουσιάστηκε σε αυτή τη διδακτορική διατριβή και αποκαλύφθηκαν πολλά μοναδικά και άγνωστα μέχρι πρότινος χαρακτηριστικά της. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η δομική ανασύσταση της PDHc (συνολικού μεγέθους 10-MDa), χωρίς τη χρήση συμμετρίας, αποκάλυψε τη χωρική εγγύτητα των συστατικών της. Έτσι σε συνδυασμό με τα προτεινόμενα στοιχειομετρικά δεδομένα (60 E2p:12 E3BP:~20 E1p:≤12 E3), παρουσιάστηκε η ελάχιστη απαιτούμενη διαδρομή για την ολοκλήρωση ενός κύκλου αντίδρασης μεταξύ των συστατικών ενζύμων. Με αυτόν τον τρόπο, ορίζεται ένα δυναμικό υπο-διαμέρισμα που οργανώνεται από τις πρωτεΐνες του πυρήνα και των πρωτεϊνών περιφερικά του πυρήνα του συμπλόκου της PDH, όπου λαμβάνει χώρα η οξείδωση του πυροσταφυλικού. Μέσω αυτής της προσέγγισης μπορεί να κατανοηθεί πιο αποτελεσματικά η δομή και η λειτουργία του συμπλόκου της PDH και των α-κετοξικών αφυδρογονασών. Έτσι αποδεικνύεται στην πράξη η δυναμική της προσέγγισης/μεθοδολογίας αυτής στη μελέτη τεράστιων ενεργών συμπλόκων, που ονομάζονται «μεταβολώνια», απευθείας από κυτταρικά εκχυλίσματα. Το γεγονός ότι οδεύουμε προς μια εποχή όπου η αυτοματοποίηση συμβάλλει όλο και περισσότερο στην απεικόνιση των κυτταρικών εκχυλισμάτων και της ενδοκυττάριας οργάνωσής τους, σε συνδυασμό με εκσυγχρονισμένες προσεγγίσεις μοριακής/κυτταρικής βιολογίας, δίνει πολλές ελπίδες για αξιοσημείωτα επιτεύγματα. Μέσω της μελέτης πιο ρεαλιστικών βιομοριακών δεδομένων προερχόμενων από κυτταρικά εκχυλίσματα, οδηγούμαστε σε ευρήματα με μεγάλη βιοτεχνολογική και ιατρική σημασία. Επίσης, ιδιαίτερη βαρύτητα θα πρέπει να δοθεί στη συμβολή της τεχνητής νοημοσύνης στη μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων εντός κυτταρικών εκχυλισμάτων. Πολύπλοκα δίκτυα βιολογικών δεδομένων μπορούν να ανακατασκευαστούν και να συγκριθούν μετέπειτα με μέλη πρωτεϊνικών κοινοτήτων διαφόρων οργανισμών. Η επαλήθευση τέτοιων δεδομένων παραμένει εξαιρετικά σημαντική, όπως για παράδειγμα, με φασματοφωτομετρία μάζας ή με μεθόδους κυτταρικής βιολογίας. Επιπλέον η επεξεργασία εικόνων με τη χρήση τεχνητής νοημοσύνης μπορεί να βοηθήσει στην αποκάλυψη νέων δομικών χαρακτηριστικών. Με τέτοια βήματα προσεγγίζεται με έναν συνδυαστικό και ολιστικό τρόπο ο βιοφυσικός χαρακτηρισμός των διαφόρων κυτταρικών λειτουργιών.

Heutzutage ist die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ein aufsteigender Stern unter den Methoden der Wahl, um die Architektur der Prozesse des Lebens zu verstehen und wurde über die letzten Jahre zu einer bedeutenden Methode für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Bis zum letzten Jahrzehnt wurde die Kryo-Elektronenmikroskopie eingesetzt, um die molekulare Organisation von bis zur Homogenität gereinigten oder in-situ-exprimierten Proteinen zu verstehen, wobei die erreichte Auflösung stark eingeschränkt war. Dank der jüngsten Fortschritte auf diesem Gebiet ist die strukturelle Charakterisierung großer, flexibler und heterogener Komplexe in Reichweite gekommen. Eine neue Ära, in der die molekulare Organisation nativer Zellextrakte untersucht wird, versucht diese Lücke zu schließen und diese beiden Ansätze miteinander zu verknüpfen. Diese neue Ära verspricht ein tieferes Verständnis der molekularen Signaturen von geordneten biologischen Systemen mit hoher Auflösung - den Molekülen des Lebens. Die strukturell aufgelöste Signatur der Fettsäure-Synthase (FAS), von Hefe in einer Auflösung von 4.7 Å, die 2017, also vor gerade einmal fünf Jahren, direkt aus nativen eukaryotischen Zellextrakten gewonnen wurde. Diese gehört zu den besten Beispielen auf diesem Gebiet, da sie die erste war, die eine nahezu atomare Auflösung aus einer hochkomplexen biologischen Probe erreichte. Interessanterweise wurden Interaktionen höherer Ordnung, die zuvor völlig unbekannt waren, bei der Wechselwirkung mit FAS beobachtet. Hervorzuheben ist, dass diese Auflösung trotz einer geringeren Anreicherung— weniger als 50 %—, in der Probe, erreicht wurde. Obwohl ein Lyse-Schritt Artefakte verursachen kann, bleiben viele Aspekte der Zellfunktionen in Zellextrakten erhalten. Im Gegensatz dazu haben all diese biomolekularen Interaktionen höherer Ordnung, die als Protein-Gemeinschaften bezeichnet werden, eine größere Chance, in ihrem (fast) nativen Zustand zu bleiben, als extensiv gereinigte oder künstlich über-exprimierte Proteine von Interesse. Ein solcher Ansatz ergänzt in hohem Maße die traditionellen molekularbiologischen Methoden und geht Hand in Hand mit dem ganzheitlichen Verständnis der molekularen Funktion. Ein großartiges Beispiel für die weitere Etablierung, Optimierung, Systematisierung und Kombination der oben genannten Ansätze wurde in den vorherigen Kapiteln beschrieben. Hier wurde die Stärke von Zellextrakten zur Erforschung von Megadalton-Komplexen (MDa), die an der Pyruvat-Oxidation, einer zentralen Stoffwechselreaktion und einem wesentlichen Bestandteil der Zellatmung, beteiligt sind, gezeigt. An der oxidativen Decarboxylierung von Pyruvat ist einer der kritischsten und wichtigsten Komplexe beteiligt, welcher als Pyruvat- Dehydrogenase-Komplex (PDHc) bekannt ist. PDHc ist ein riesiger Enzymkomplex aus drei Kernkomplexen E1, E2/E3BP und E3 in multiplen Kopien, die Pyruvat in Acetyl-CoA umwandeln. Acetyl-CoA kann dann im Krebszyklus, im Zuge der Zellatmung, weiterverwendet werden, so dass dieser Komplex die Glykolyse mit dem Krebszyklus verbindet. Die Pyruvat- Decarboxylierung wird auch als "Pyruvat-Dehydrogenase-Reaktion" bezeichnet, da sie auch die Oxidation von Pyruvat beinhaltet. Die PDHc ist aufgrund ihrer Heterogenität, ihrer relativ enormen Größe sowie ihrer Plastizität ein sehr komplexes System, dessen Bestandteile zwar isoliert charakterisiert wurden, jedoch dessen Quartärstruktur nie im Detail untersucht wurde. In den vorangegangenen Kapiteln wurden vollständige Chaetomium thermophilum α- Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexe in nativen Zellextrakten identifiziert. Ihre Domänenanordnungen wurden mit Hilfe von Massenspektrometrie, Aktivitätsuntersuchungen, Crosslinking, Elektronenmikroskopie und computergestützter Strukturmodellierung charakterisiert. Es wurde über eine Kryo-EM-Struktur des PDHc-Kerns berichtet, die viele einzigartige und bisher unbekannte Merkmale offenbarte. Interessanterweise zeigte eine asymmetrische Rekonstruktion einer 10-MDa-PDHc die räumliche Nähe ihrer Komponenten und legt zusammen mit den vorgeschlagenen stöchiometrischen Daten (60 E2p:12 E3BP:~20 E1p:≤12 E3) einen minimalen Reaktionsweg zwischen den Komponentenenzymen nahe. Auf diese Weise wurde ein dynamisches Pyruvat-Oxidationskompartiment definiert, das durch Kern- und periphere Proteinspezies der PDHc organisiert wird. In diesem Zusammenhang konnte ein tieferes Verständnis der Struktur, sowie Funktion des PDHc- und α-Ketosäure- Dehydrogenase-Komplexes erreicht werden. Des Weiteren wird die Stärke des gesamten Ansatzes/der Methodik zur Untersuchung großer aktiver Komplexe, welche als Metabolone bezeichnet werden, direkt aus nativen Zellextrakten in der Praxis bewiesen. Andere Ansätze wie moderne proteomische Methoden, Crosslinking-experimente, Netzwerkbiologie und biophysikalische Modellierung können nun auf Zellextrakte angewandt werden und bieten neue Einblicke in diese Art von Studien. Durch die Automatisierung der Bildgebung von Zellextrakten mit ihrer intrinsischen Organisation, lässt in Verbindung mit der Integration von molekular- und zellbiologischen Ansätzen, auf bemerkenswerte Erfolge bei der Untersuchung lebensnaher biomolekularer Zustände von ausgeprägter biotechnologischer und medizinischer Bedeutung hoffen. In dieser Richtung können auch verschiedene Ansätze des maschinellen Lernens angewandt werden, um Protein-Protein-Interaktionen in Zellextrakten zu entdecken. Dedizierte biologische Netzwerke in denen Mitglieder der Proteingemeinschaften unterschiedlicher Organismen rekonstruiert und identifiziert werden. Die Validierung ist nach wie vor von großer Bedeutung, z.B. bei der Crosslinking-Massenspektrometrie oder bei zellbiologischen Methoden. Die Anwendung von Bildverarbeitungsabläufen, die von Techniken des maschinellen Lernens inspiriert sind, können bei der Unterscheidung von strukturellen Signaturen helfen. Die Korrelation von Proteom- und Netzwerkdaten mit diesen Signaturen wird die Rekonstruktion von Kryo-EM-Karten verbessern und gleichzeitig helfen, unentdeckte und völlig unbekannte Proteingemeinschaften mit hoher Auflösung zu charakterisieren. Die Integration von maschinellem Lernen, Kryo-EM und ergänzenden strukturellen proteomischen Ansätzen kann eindeutig die Grundlage für eine ganzheitliche molekulare Beschreibung von Proteingemeinschaften in nativen Zellextrakten bilden. Letztendlich nähern sich solche Schritte der biophysikalischen Charakterisierung von Zellfunktionen auf integrative und ganzheitliche Weise.