Αναγνώριση και χαρακτηρισμός ρυθμιστικών δικτύων ενισχυτών κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό

Abstract

Cellular reprogramming of somatic cells towards induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) is achieved through the over-expression of the transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc (OSKM). Due to the high complexity of the process, the vast number of the involved molecules and its stochastic and inefficient nature, the molecular background of reprogramming is only partially revealed. The aim of this Doctoral Thesis was the identification of genomic regulatory elements which are induced during cellular reprogramming, the examination of their action and their association with the expression of important genes. To achieve this, we used a combination of different molecular, imaging, high-throughput, and bioinformatics techniques. First, we constructed a combined ChIP-seq OSKM dataset using experiments on MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts) from multiple published studies, in order to examine the universal OSKM binding upon the genome, irrespective of minor discrepancies originating from the different reprogramming systems and protocols used. Initially, we focused on the ESC-related sites (Embryonic Stem Cells, natural equivalent of iPSCs) and found out that almost 1/3 of them are bound by OSKM as early as at day 1, or since MEFs («Early-bound ESC sites»). Our analysis highlighted the significant role of Myc in reprogramming, which is often overlooked. We saw that, along with Klf4, they “mark” positions where Oct4 and/or Sox2 will bind after reprogramming initiation. Furthermore, we discovered that various genes are regulated by multiple genomic elements, where OSKM bind at different timepoints in reprogramming. For example, many genes involved in the MET pathway (Mesenchymal to Epithelial Transition) are located near both ESC-, MEF- and Transient-OSKM sites, resulting in stably high expression levels which temporarily increase during the intermediate timepoints. Finally, we observed that OSKM often bind on the chromatin in a dynamic fashion. This “on-and-off” association of OSKM with the genome is related to the need of chromatin reorganization to achieve pluripotency. We wished to take advantage of the results of our genomics analysis in order to identify DNA regulatory elements which are induced in cellular reprogramming (Reprogramming Inducible Enhancers, RIEs) and use their activation as a marker of successful pluripotency acquisition. In other words, we wanted to use the RIEs as “traps” (enhancer traps) for the identification of cells which reprogram with higher efficiency. For this, we focused on the ESC sites which are bound by OSKM early, but only after the MEF stage (day 1, «de novo Early-bound ESC sites»). Among these inducible elements we chose the regions with high number of OSKM peaks, which reside near genes (0-2.5kb upstream/downstream) which are over-expressed in reprogramming, in order to end up with genomic loci with enhancer characteristics. We randomly chose three of these regions for downstream analyses. In particular, we cloned three elements residing upstream of Lefty1, Pou5f1 (Oct4) and Upp1 genes next to a GFP gene, in order to perform reporter assays. Our results showed that all three loci (Lefty1-700, Pou5f1-1800, Upp1-800) act as enhancers and are induced in MEFs which acquire an epithelial phenotype (MET) and often form early iPSC colonies. Importantly, the Upp1-800 enhancer, contrary to the other two, possesses all the necessary sequences for the regulation of the respective gene throughout reprogramming. Cells sorted at day 4 based on Upp1-800 activation (Upp1-800-GFP(+) cells) get reprogrammed with double efficiency rate compared to the rest of the population (Upp1-800-GFP(-) cells). In conclusion, using our unbiased method for the detection of RIE enhancers, we identified a new early reprogramming marker, the Upp1-800 enhancer. Next, we wished to use this new reprogramming marker to study the cells within which it is induced and thus reveal new, unknown mechanisms of cellular reprogramming. In this context, we performed RNA-seq analysis of the Upp1-800-GFP(+) and GFP(-) cells during the early stages of reprogramming (day 2-4). We found out that the Upp1-800 enhancer marks cells which have induced gene networks involved in MET and which present an increased expression of the 9TR factors Gli2 and Irf6 and of the metallopeptidase Mmp9. Previous experiments in our laboratory have shown that the 9TR network plays a key role in the activation of Nanog and the achievement of pluripotency, and also, that Mmp9 is important for the successful completion of reprogramming. Based on the RNA-seq results and on other analyses, we produced a putative model describing the molecular events involved in the effective emergence of iPSC colonies from the Upp1-800-GFP(+) cells. In more detail, the efficient over-expression of the OSKM transgenes during the first 2 days of reprogramming leads to the temporary induction of Gli2 and Irf6, via the direct OSKM binding at the respective regulatory regions (day 2-4). In parallel, OSKM activate the Upp1-800 enhancer-reporter, leading to the expression of GFP (Upp1-800-GFP(+) cells). Irf6, then, binds at the Mmp9 and Nanog genes’ regulatory regions and induces them. This contributes to the efficient phenotypical transition of cells and the establishment of pluripotency. On the contrary, OSKM are expressed at relatively lower levels during the first 2 days in the GFP(-) cells, resulting in the delayed Irf6 and Gli2 over-expression and in the inability of Mmp9 and Nanog to reach sufficiently high expression levels. Finally, we got interested in investigating how Mmp9 contributes to the achievement of pluripotency. Transcriptomic analysis of Mmp9 knocked-down cells, or cells treated with an MMP9 inhibitor confirmed previous results of our laboratory, highlighting the role of MMP9 in MET. In more detail, we saw that in the absence of active MMP9 in the cells classic mesenchymal markers are over-expressed, while epithelial genes and reprogramming markers are suppressed. Furthermore, we found out that Mmp9 forms a positive regulatory feedback loop with Irf6 and Nanog. These two factors bind to the Mmp9 regulatory region and induce its expression, while Mmp9 preserves and/or ensures the expression of Irf6 and Nanog genes. Apart from MET, Mmp9 affects multiple other cellular functions, like cell death, metabolism and proliferation. This is achieved by the direct or indirect effect of MMP9 activity on the expression of multiple central genes like Cdh1 (E-cad), Acta2 and Mapk3.To conclude, in the present Doctoral Thesis we studied the OSKM activity in cellular reprogramming and developed an unbiased methodology for the identification and functional study of DNA elements acting as RIE enhancers. Using this methodology we identified a novel early reprogramming marker and discovered important molecular mechanisms which take place in cells undergoing reprogramming. We proposed a model connecting the activity of OSKM, the 9TR factors and Mmp9 and showcased for the first time in detail the central and pleiotropic mode of action of the metallopeptidase 9 in reprogramming.

Ο κυτταρικός επαναπρογραμματισμός σωματικών κυττάρων προς επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPSCs) πραγματοποιείται μέσω της υπέρ-έκφρασης τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων, των Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc (OSKM). Λόγω της υψηλής πολυπλοκότητας του φαινομένου, του μεγάλου αριθμού των εμπλεκόμενων μορίων και της στοχαστικής και αναποτελεσματικής του φύσης, δεν έχουν αποκαλυφθεί ακόμα όλοι οι μοριακοί μηχανισμοί που το διέπουν. Σκοπός της παρούσας Διατριβής ήταν η ταυτοποίηση ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδιώματος τα οποία ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού, η διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο δρουν και ο συσχετισμός τους με την έκφραση σημαντικών γονιδίων. Για την επίτευξη των ανωτέρω στόχων χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός διαφορετικών μοριακών, απεικονιστικών τεχνικών, γονιδιωματικών προσεγγίσεων υψηλής απόδοσης και μεθόδων υπολογιστικής βιολογίας. Αρχικά διαμορφώσαμε ένα συνδυαστικό ChIP-seq σετ δεδομένων για τους OSKM προερχόμενο από πειράματα πολλαπλών δημοσιευμένων μελετών σε κύτταρα MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts), με σκοπό να μελετήσουμε την πρόσδεση των OSKM στο γονιδίωμα ανεξάρτητα από μικροδιαφορές μεταξύ των διαφορετικών συστημάτων και πρωτοκόλλων επαναπρογραμματισμού. Αρχικά εστιάσαμε στις ESC-σχετιζόμενες περιοχές (Embryonic Stem Cells, φυσικό ανάλογο των iPSCs) και διαπιστώσαμε ότι σχεδόν το 1/3 αυτών προσδένονται από τους OSKM ήδη από την 1η ημέρα του επαναπρογραμματισμού, ή/και από το στάδιο των MEFs («Early-bound ESC θέσεις»). Η ανάλυσή μας ανέδειξε το σημαντικό ρόλο του Myc στον επαναπρογραμματισμό, ο οποίος συχνά παραβλέπεται. Διαπιστώσαμε ότι μαζί με τον Klf4 «μαρκάρουν» θέσεις οι οποίες κατά τον επαναπρογραμματισμό θα καταληφθούν από τους Oct4 και Sox2. Περαιτέρω, ανακαλύψαμε ότι αρκετά γονίδια ρυθμίζονται παράλληλα από πολλαπλές γενωμικές θέσεις, όπου οι OSKM μπορεί να προσδένονται με διαφορετικό χρονικό πρότυπο. Για παράδειγμα, πολλά γονίδια τα οποία σχετίζονται με την -απαραίτητη για τον επαναπρογραμματισμό- διαδικασία της MET (Mesenchymal to Epithelial Transition) βρίσκονται ταυτόχρονα κοντά σε ESC-, MEF- και Transient-OSKM θέσεις, με αποτέλεσμα η έκφρασή τους να είναι σταθερά υψηλή, αλλά να επάγεται περαιτέρω στα ενδιάμεσα χρονικά σημεία του φαινομένου. Τέλος, παρατηρήσαμε ότι οι OSKM πολύ συχνά προσδένονται στη χρωματίνη με δυναμικό τρόπο. Αυτή η «on-and-off» σχέση των OSKM με το γονιδίωμα σχετίζεται με την ανάγκη αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης ώστε να εγκαθιδρυθεί η πολυδυναμία. Σκεφτήκαμε να εκμεταλλευτούμε τα δεδομένα της γονιδιωματικής ανάλυσης που πραγματοποιήσαμε, ώστε να ταυτοποιήσουμε ρυθμιστικά στοιχεία επαγόμενα κατά τον επαναπρογραμματισμό (Reprogramming Inducible Enhancers, RIEs) και να χρησιμοποιήσουμε την ενεργοποίησή τους ως πρώιμο δείκτη της επιτυχημένης απόκτησης πολυδυναμίας. Δηλαδή, θελήσαμε να χρησιμοποιήσουμε τους RIEs ως «παγίδες» (enhancer traps) για την ανίχνευση κυττάρων τα οποία επαναπρογραμματίζονται με αυξημένη αποτελεσματικότητα. Για το σκοπό αυτό εστιάσαμε στις ESC θέσεις πρόσδεσης οι οποίες καταλαμβάνονται από τους OSKM νωρίς, αλλά μόνο έπειτα από το στάδιο των MEFs (ημέρα 1, «de novo Early-bound ESC θέσεις»). Από τα επαγώγιμα αυτά στοιχεία επιλέξαμε τις περιοχές με υψηλό αριθμό γεγονότων πρόσδεσης από τους OSKM (peaks), οι οποίες βρίσκονται κοντά σε γονίδια (0-2,5kb ανοδικά, ή καθοδικά) που υπέρ-εκφράζονται στον επαναπρογραμματισμό, ώστε να καταλήξουμε σε γενωμικές περιοχές με χαρακτηριστικά ενισχυτών. Από αυτές αποφασίσαμε ενδεικτικά να εστιάσουμε σε 3 περιοχές ανοδικά από τα γονίδια Lefty1, Pou5f1 (Oct4) και Upp1, τις οποίες κλωνοποιήσαμε άνωθεν του γονιδίου GFP για την πραγματοποίηση δοκιμασιών αναφοράς. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι και τα τρία στοιχεία DNA (Lefty1-700, Pou5f1-1800, Upp1-800) δρουν ως ενισχυτές και επάγονται σε κύτταρα MEFs τα οποία αποκτούν επιθηλιακό φαινότυπο (MET) και συχνά διαμορφώνουν πρώιμες αποικίες iPSC. Μάλιστα, ο ενισχυτής Upp1-800, σε αντίθεση με τους άλλους δύο, διαθέτει όλες τις απαραίτητες αλληλουχίες για τη ρύθμιση της έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου καθ’ όλη τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού. Κύτταρα τα οποία επιλέχθηκαν την ημέρα 4 με βάση την ενεργοποίηση του Upp1-800 (Upp1-800-GFP(+) κύτταρα) επαναπρογραμματίζονται με κατά μέσο όρο διπλάσια αποτελεσματικότητα σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό (Upp1-800-GFP(-) κύτταρα). Συνεπώς, μέσω της αμερόληπτης μεθόδου αναγνώρισης πιθανών RIE ενισχυτών την οποία αναπτύξαμε, ταυτοποιήσαμε ένα νέο πρώιμο δείκτη επαναπρογραμματισμού, τον ενισχυτή Upp1-800.Στη συνέχεια, θελήσαμε να χρησιμοποιήσουμε αυτό το νέο δείκτη ώστε να μελετήσουμε τα κύτταρα τα οποία «μαρκάρει» και να αποκαλύψουμε νέους, μη μελετημένους μηχανισμούς του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού. Στο πλαίσιο αυτό πραγματοποιήσαμε ανάλυση μεταγραφωμάτος (RNA-seq) στα Upp1-800-GFP(+) και GFP(-) κύτταρα κατά τα πρώιμα στάδια του επαναπρογραμματισμού (ημέρα 2-4). Διαπιστώσαμε ότι ο ενισχυτής Upp1-800 επισημαίνει τα κύτταρα όπου ενεργοποιούνται γονιδιακά δίκτυα σχετιζόμενα με τo μονοπάτι της MET και τα οποία παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση των 9TR παραγόντων Gli2 και Irf6 και της μεταλλοπεπτιδάσης Mmp9. Από παλαιότερα πειράματα του εργαστηρίου μας γνωρίζουμε ότι το δίκτυο των 9TRs χρειάζεται για την ενεργοποίηση του Nanog και την απόκτηση πολυδυναμίας και η δράση της Mmp9 είναι σημαντική για την επιτυχημένη ολοκλήρωση του επαναπρογραμματισμού. Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα της ανάλυσης RNA-seq και σε άλλες αναλύσεις καταλήξαμε σε ένα πιθανό μοντέλο που περιγράφει την εξέλιξη των μοριακών γεγονότων τα οποία συμβάλλουν στην αποτελεσματική παραγωγή αποικιών iPSC από τα Upp1-800-GFP(+) κύτταρα. Αναλυτικά, η αποτελεσματική υπέρ-έκφραση των διαγονιδίων των OSKM τις 2 πρώτες ημέρες του επαναπρογραμματισμού οδηγεί στην παροδική επαγωγή των παραγόντων Gli2 και Irf6, μέσω της άμεσης πρόσδεσής τους στις αντίστοιχες ρυθμιστικές περιοχές (ημέρα 2-4). Παράλληλα, οι OSKM ενεργοποιούν τον enhancer-reporter Upp1-800, οδηγώντας στην έκφραση της GFP (Upp1-800-GFP(+) κύτταρα). Ο Irf6, με τη σειρά του, προσδένεται στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της Mmp9 και του Nanog, και τα επάγει. Αυτό συμβάλλει στη φαινοτυπική μεταβολή των κυττάρων και στην εγκαθίδρυση της πολυδυναμίας. Αντίθετα, στα GFP(-) κύτταρα οι OSKM εκφράζονται σε σχετικά χαμηλότερα επίπεδα τις 2 πρώτες ημέρες, με αποτέλεσμα να καθυστερεί η υπέρ-έκφραση των Irf6 και Gli2, και να μην επιτυγχάνεται η έκφραση του γονιδίου της Mmp9 και του Nanog σε υψηλά επίπεδα.Τέλος, ενδιαφερθήκαμε να διερευνήσουμε τον τρόπο με τον οποίο η μεταλλοπεπτιδάση Mmp9 συμβάλλει στην απόκτηση της πολυδυναμίας. Μελέτη του μεταγραφώματος κυττάρων στα οποία πραγματοποιήθηκε μεταγραφική σίγαση ή χημική αναστολή της MMP9 επιβεβαίωσε παλαιότερα πειράματα του εργαστηρίου, υπογραμμίζοντας το ρόλο της στην επιθηλιοποίηση (ΜΕΤ). Πιο αναλυτικά, απουσία της δράσης της Mmp9 διαπιστώσαμε ότι υπέρ-εκφράζονται κλασικοί μεσεγχυματικοί δείκτες, ενώ μειώνεται η έκφραση επιθηλιακών γονιδίων και δεικτών του επαναπρογραμματισμού. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η Mmp9 διαμορφώνει ένα κύκλο θετικής ανατροφοδότησης με τους παράγοντες Irf6 και Nanog, καθώς αφενός αυτοί προσδένονται στη ρυθμιστική της περιοχή επάγοντας την έκφρασή της και αφετέρου η Mmp9 συντηρεί ή/και διασφαλίζει την έκφραση των δυο αυτών γονιδίων. Εκτός από τη MET, η Mmp9 επηρεάζει πολλαπλές άλλες κυτταρικές λειτουργίες, όπως τον κυτταρικό θάνατο, το μεταβολισμό και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της άμεσης ή έμμεσης επίδρασης της μεταλλοπεπτιδάσης στην έκφραση πολλαπλών κομβικών γονιδίων όπως είναι τα Cdh1 (E-cad), Acta2 και Mapk3.Συνοψίζοντας, στο πλαίσιο της παρούσας Διατριβής μελετήσαμε τη δραστηριότητα των OSKM στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό και αναπτύξαμε μια αμερόληπτη μεθοδολογία για την αναγνώριση και λειτουργική μελέτη στοιχείων στο DNA με ρόλο RIE ενισχυτών. Μέσω αυτής ταυτοποιήσαμε έναν νέο πρώιμο δείκτη επαναπρογραμματισμού και ανακαλύψαμε σημαντικούς μοριακούς μηχανισμούς οι οποίοι τελούνται στα κύτταρα τα οποία επαναπρογραμματίζονται. Προτείναμε ένα μοντέλο το οποίο συνδέει τη δράση των OSKM, των παραγόντων 9TR και της μεταλλοπεπτιδάσης 9 και αναδείξαμε για πρώτη φορά με λεπτομέρεια τον κομβικό και πλειοτροπικό ρόλο της Mmp9 στον επαναπρογραμματισμό.