Δομικές μελέτες ενζύμων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος με έμφαση στις β-υδρολάσες αποικοδόμησης της φυτικής βιομάζας

Abstract

The utilization of lignocellulose as source of reduced carbon for the production of biofuels and chemicals is one of the most pertinent directions of industrial biotechnology. For this purpose the quest for improved hydrolytic rates of lignocellulose substrate hydrolysis with the aid of stable biocatalysts at high temperatures has become apparent. Lignocellulose degradation at anaerobic cellulolytic bacteria requires multienzyme complexes, the cellulosomes. These protein superstructures are composed of a non-catalytic subunit called scaffoldin, which comprises cohesin modules and includes one carbohydrate-binding module commonly referred to as CBM (Cellulose Binding Module, CBM) unlike free hydrolytic enzymes that have one cellulose-binding CBM each. Scaffoldin may interact with an array of hydrolytic enzymes that contain a complementary type of module –dockerin- which is complementary and binds to the cohesin modules of the scaffoldin subunit, forming strong protein:protein interactions. The structural studies of the distinct enzymes that compose the artificial cellulosome are important for underlining the structure-function relationships of cellulosomes and the selection of the appropriate modifications to turn to tailor-made biocatalysts. In the frame of the present thesis, the following molecular targets were examined: β-glucosidase (βGl) from the microorganism Caldicellulosiruptor sacchrolyticus, the chimeric enzyme βGl:doct that is fused with a dockerin t from Clostridium thermocellum (βGl-doct), cellulase Cel5 from thermophilus bacterium Geobacillus sp50 and the chimeric enzyme Cel5:doct. The expression of the macromolecular targets was performed using pET plasmids, their purification was conducted by FPLC, anion exchange and size exclusion chromatography, and then they were subjected to crystallization trials with the aid of conventional and automated infrastructure. The crystals formed for some of the proteins, were then exposed to X-ray synchrotron radiation at PETRA III / EMBL-Hamburg Unit, DESY, Hamburg, Germany for their structural characterization while for the rest in silicο studies were performed to determine computationally their 3D structure. More specifically, the 3D structure of β-Gl was determined by X-ray crystallography at resolution 1.47 Å and the structure of one of its complexes with a β-D-glucose molecule, which is the product of the reaction that βGl catalyses when lactose was used as substrate at 1.95 Å resolution. The results showed that the 3D structure of βGl from Caldicellulosiruptor sacchrolyticus follows the overall architecture of GH1 family and at the catalytic site of the enzyme, residues Glu163 και Glu361, calculation of the electron density 2Fo-Fc maps showed that for the enzyme without the substrate at the catalytic site a glycerol molecule was bound and interacted with the catatytic residues, but when lactose was used as substrate then at the active site there was sufficient density to accommodate a molecule of β-D-glucose which is the product of the catalytic reaction that was held in the crystal. Comparison of βGl with other β-glucosidases either sequence or structural homologues showed that βGl is quite similar except for the region comprising residues (226-241) that forms a flexible loop and adopts different conformation compared to other enzymes and may be targeted for further studies with protein engineering to decipher the plausible functional role of this region. Crystals were grown for the chimeric enzyme βGl:doct, in more than conditions and diffraction data were collected at low resolution about 4.2 Å from several crystals. The difference electron density map 2Fo-Fc showed that there is sufficient electron density only for βGl but not for doct. Therefore, computational studies for the chimeric enzyme βGl:doct were performed with the aid of iTASSER-MTD which produces more accurate predictions for the three dimensional structures of proteins with more than one domains as well as AlphaFold. The results showed that the loop that connects βGl with doct is rather flexible, thus is has been a challenge for the determination of their relative position computationally. The doct structure when alone is rather stable, rich in secondary structures, mainly α-helices that form intramolecular hydrogen bond interactions. The chimeric βGl:doct was subjected to iTASSER-MTD server that has the capacity to define distinct domains which gave the best results that showed the two domains to be connected with a hairpin loop the conformation of which is determinant for the quaternary conformation of the chimeric enzyme. Further studies with point or multiple mutations may limit the flexibility of the loop advancing the understanding of the functional role of this region. In the case of cellulase, the studies performed for the chimeric enzyme Cel5:doct, were similar to the ones that were performed for the other enzymes. Crystallisation trials did not lead to the growth of high-quality diffracting crystals that would lead to the collection of diffraction data sufficient to determine the 3D structure of the enzyme. Therefore, the iTasser-MTD was used and the results showed that only part of the secondary structure elements of cel5 follow the folding of GH5 family that it belongs while the loop region that connects the two individual domains, as it was anticipated, is quite flexible it also acts as a hairpin preventing though the software to accurately predict the overall three dimensional structure. In conclusion the studies of the distinct and chimeric enzymes aim for the extraction of the structural features that would indicate the appropriate modifications for the rational design of artificial cellulosomes as ideal modular biocatalysts the composition of which may vary depending on their application. Use of the microorganisms Caldicellulosiruptor and Geobacillus that have been isolated from thermophilic of selected Greek regions exhibit great interest because they may give attributes to the enzyme they produce that would have tremendous impact on industrial processes.

Η αξιοποίηση της λιγνινοκυτταρίνης ως πηγή ανηγμένου άνθρακα για την παραγωγή βιοκαυσίμων και χημικών, αποτελεί μια από τις πλέον σύγχρονες ερευνητικές κατευθύνσεις της βιομηχανικής βιοτεχνολογίας. Για τον σκοπό αυτό η εύρεση τρόπων βελτίωσης των ρυθμών υδρόλυσης των λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων, με τη βοήθεια σταθερών βιοκαταλυτών σε υψηλές θερμοκρασίες, έχει καταστεί αναγκαία. Η αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρίνης, στην περίπτωση των αναερόβιων κυτταρινολυτικών βακτηρίων, πραγματοποιείται μέσω της έκκρισης πολυπρωτεϊνικών συμπλεγμάτων τα οποία ονομάζονται κυτταρινοσώματα. Τα κυτταρινοσώματα συγκροτούνται από την κύρια πρωτεϊνική υπομονάδα στήριξης (scaffoldin), η οποία συντίθεται από τις επί μέρους μονάδες σύνδεσης (cohesins) και η οποία φέρει μία μόνο θέση πρόσδεσης στην κυτταρίνη (Cellulose Binding Module, CBM) σε αντίθεση με τα ελεύθερα υδρολυτικά ένζυμα που φέρουν μια CBM έκαστο. Πάνω στην υπομονάδα στήριξης μπορεί να προσδεθούν, μέσω ισχυρών δια-πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, μια σειρά από υδρολυτικά ένζυμα που διαθέτουν επικράτειες αγκίστρωσης (dockerins) συμπληρωματικές ως προς τις αντίστοιχες μονάδες σύνδεσης. Οι δομικές μελέτες των επί μέρους ενζύμων που συνθέτουν το τεχνητό κυτταρινόσωμα είναι απαραίτητες για την ανάδειξη των σχέσεων δομής-δράσης/λειτουργίας των τεχνητών κυτταρινοσωμάτων, αλλά και για τη διεξαγωγή των κατάλληλων τροποποιήσεων προκειμένου να γίνουν ιδανικοί βιοκαταλύτες (tailor-made biocatalysts). Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν οι εξής στόχοι: β-γλυκοζιδάση (βGl) από τον μικροοργανισμό Caldicellulosiruptor sacchrolyticus, το χιμερικό ένζυμο βGl:doct που φέρει επικράτεια αγκίστρωσης t από το Clostridium thermocellum (βGl-doct), κυτταρινάση Cel5 από το θερμόφιλο βακτήριο Geobacillus sp50 (Cel5) και χιμερικό ένζυμο Cel5:doct. Για την έκφραση των μακρομοριακών στόχων χρησιμοποιήθηκαν πλασμίδια τύπου pET, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με υγρή χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και μοριακής διήθησης και υποβλήθηκαν σε δοκιμές κρυστάλλωσης με χρήση συμβατικών και ρομποτικών διατάξεων. Εξ’ αυτών για όσες πρωτεΐνες αναπτύχθηκαν κρύσταλλοι ακολούθησε έκθεση σε ακτίνες Χ συγχροτρονικής ακτινοβολίας στο PETRA III / EMBL-Hamburg Unit, c/o DESY, Hamburg, Germany και o δομικός χαρακτηρισμός αυτών, ενώ για τις υπόλοιπες που μελετήθηκαν πραγματοποιήθηκαν in silicο μελέτες για τον προσδιορισμό, υπολογιστικά, της τριδιάστατης δομής τους. Ειδικότερα, προσδιορίστηκε η τριδιάστατη δομή της β-Gl, με χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ, σε διακριτική ικανότητα 1.47 Å καθώς και ενός συμπλόκου αυτής με ένα μόριο β-D-γλυκόζης, προϊόν της καταλυτικής δράσης του ενζύμου όταν χρησιμοποιήθηκε η λακτόζη ως υπόστρωμα, σε διακριτική ικανότητα 1.95 Å. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τριδιάστατη δομή της βGl από Caldicellulosiruptor sacchrolyticus ακολουθεί το τυπικό δίπλωμα της οικογενείας GH1 και στο καταλυτικό κέντρο του ενζύμου, αμινοξέα Glu163 και Glu361, ο υπολογισμός του χάρτη διαφοράς ηλεκτρονιακής πυκνότητας 2Fo-Fc και Fo-Fc έδειξε ότι για το μεν ένζυμο χωρίς υπόστρωμα, στο καταλυτικό κέντρο είχε προσδεθεί ένα μόριο γλυκερόλης το οποίο αλληλεπιδρά με τα καταλυτικά αμινοξέα, ενώ όταν είχε χρησιμοποιηθεί η λακτόζη ως υπόστρωμα στο καταλυτικό κέντρο υπήρχε ικανή πυκνότητα να φιλοξενήσει ένα μόριο β-D-γλυκόζης το οποίο προέκυψε ως προϊόν της κατάλυσης που πραγματοποιήθηκε στον κρύσταλλο. Σύγκριση της δομής της βGl με άλλες ομόλογες β-γλυκοζιδάσες είτε ως προς την αμινοξική ακολουθία είτε ως προς τη δομή, έδειξε ότι η βGl είναι αρκετά όμοια εκτός από την υποπεριοχή (226-241) όπου αποτελείται από έναν εύκαμπτο βρόχο που λαμβάνει αρκετά διαφορετική διαμόρφωση έναντι των άλλων ενζύμων και μπορεί να αποτελέσει στόχο για περαιτέρω μελέτες πρωτεϊνικής μηχανικής για την περαιτέρω διερεύνηση και τον πλήρη χαρακτηρισμό της λειτουργικής ιδιότητας αυτής της περιοχής. Επίσης, αναπτύχθηκαν κρύσταλλοι για το χιμαιρικό ένζυμο βGl:doct, σε περισσότερες από μια συνθήκες, συλλέχθηκαν δεδομένα περίθλασης σε χαμηλή διακριτική ικανότητα περί τα 4.2 Å με έκθεση περισσοτέρων από έναν κρυστάλλων και ο υπολογισμός του χάρτη διαφοράς ηλεκτρονιακής πυκνότητας 2Fo-Fc και Fo-Fc έδειξε ότι δεν υπάρχει πρόσθετη ηλεκτρονιακή πυκνότητα για το τμήμα της doct παρά μόνο για την βGl. Για τον σκοπό αυτό έγιναν υπολογιστικές μελέτες για το χιμερικό ένζυμο βGl:doct με τη χρήση του εξυπηρετητή iTASSER-MTD κατάλληλο για ακριβέστερες προβλέψεις για τριδιάστατες δομές πρωτεϊνών με περισσότερες από μια περιοχές καθώς και με το AlphaFold. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο βρόχος που συνδέει τη βGl με την doct είναι αρκετά εύκαμπτος και αποτέλεσε ιδιαίτερη πρόκληση για τον προσδιορισμό της σχετικής τους θέσης υπολογιστικά. Η δομή της doct όταν αυτή είναι μόνη της είναι αρκετά σταθερή πλούσια σε δευτεροταγή στοιχεία που σχηματίζουν ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου. Στο χιμαιρικό ένζυμο βGl:doct μόνον ο εξυπηρετητής iTASSER-MTD, ο οποίος έχει τη δυνατότητα να λαμβάνει υπ΄όψιν επί μέρους υποπεριοχές, έδωσε τα βέλτιστα αποτελέσματα τα οποία φέρουν τις δύο υποπεριοχές να συνδέονται με έναν βρόχο που λειτουργεί ως «φουρκέτα» (hairpin), η διαμόρφωση του οποίου υπαγορεύει και την τεταρτοταγή δομή του χιμαιρικού ενζύμου. Περαιτέρω μελέτες με σημειακές ή/και πολλαπλές μεταλλάξεις που θα διερευνήσουν την ευκαμψία του εν λόγω βρόχου ως προς τη λειτουργία του ενζύμου, θα συνεισφέρουν στην καλύτερη κατανόηση του ρόλου αυτής της περιοχής. Στην περίπτωση της κυτταρινάσης και του χιμερικού ενζύμου Cel5:doct, πραγματοποιήθηκαν, κατ΄ αναλογία των προηγούμενων ενζύμων, δοκιμές κρυστάλλωσης οι οποίες όμως δεν έδωσαν κρυστάλλους κατάλληλης ποιότητας για τη συλλογή κρυσταλλογραφικών δεδομένων. Για αυτόν τον λόγο ακολουθήθηκε η υπολογιστική προσέγγιση με χρήση του εξυπηρετητή iTasser-MTD και σε αυτήν την περίπτωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μόνο μέρος των δευτεροταγών στοιχείων της cel5 ακολουθούν το δίπλωμα της οικογενείας GH5 στην οποία ανήκουν ενώ και σε αυτήν την περίπτωση ο εύκαμπτος βρόχος που συνδέει τις δύο υποπεριοχές cel5 και doct λειτουργεί ξανά ως φουρκέτα παρεμποδίζοντας τον ακριβή προσδιορισμό της τριδιάστατης δομής. Συμπερασματικά, η μελέτη τόσο των διακριτών όσο και των χιμαιρικών ενζύμων αφορά στη εξαγωγή των δομικών αυτών χαρακτηριστικών που υποδεικνύουν τις δέουσες τροποποιήσεις για τον ορθολογικό σχεδιασμό τεχνητών κυτταρινοσωμάτων ως ιδανικών βιοκαταλυτών, η «σύσταση» των οποίων θα δύναται να προσαρμόζεται κατά περίπτωση. Η χρήση των οργανισμών Caldicellulosiruptor και Geobacillus τα οποία έχουν απομονωθεί από "θερμά" ενδιαιτήματα του Ελλαδικού χώρου παρουσιάζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον γιατί προσδίδουν στα παραγόμενα ένζυμα επιθυμητές ιδιότητες για την αξιοποίησή τους σε βιομηχανικές διεργασίες.