Discovery of potential therapeutic molecules against neurodegenerative diseases caused by aberrant protein folding and aggregation using synthetic biology and molecular evolution methods

Abstract

Cu/Zn Superoxide Dismutase 1 (SOD1) is a 32-kDa homodimeric enzyme expressed predominantly in the cytosol, catalyzing the reaction of superoxide radicals O2- to harmless O2 and H2O2. It is a metalloenzyme with copper enabling the redox cycle responsible for its activity, zinc stabilizing the native dimeric conformation and an intramolecular disulfide bond stabilizing the native structure. Mutations in the SOD1 are related to ALS disease, which is pathologically distinguished by atrophy and death of the affected motor neurons which lead to disease-associated mortality. ALS-associated SOD1 mutations are related to a mild reduction of the enzyme’s activity but their deleterious effect is mediated through a gain of function mechanism, rather than a loss of function effect, as proposed by cellular models and transgenic animal studies. Transgenic mice overexpressing ALS-associated SOD1 mutations develop symptoms of the disease while SOD1 knock-out mice are not susceptible to motor neuron loss. The mechanism by which SOD1 mutants cause selective motor neuron death still remains elusive. Cellular functions affected by mutations include: reduced dismutase activity, changes in the function of glutamate transporter’s related to excitotocixity, intracellular copper dyshomeostasis and increased protein’s propensity to midfold and aggregate, a mechanism which this thesis is dedicated. Protein misfolding and aggregation is an important aspect of ALS since ubiquitinated protein inclusions containing SOD1 in the cytosol of motor neurons constitutes an indisputable finding and hallmark of the disease. The present work describes an attempt to discover compounds as rescuers of misfolding and aggregation of SOD1(A4V) with potentially therapeutic properties against ALS, using two different approaches. The first approach exploits the drug repurposing advantages. We performed an in vitro screening of a well-characterized library of 1280 pharmacologically active compounds, LOPAC®. Each compound of the library was tested against SOD1(A4V) mutant and its ability to increase proteins thermal stability was assessed with Differential Scanning Fluorimetry Technique (DSF), in a high-throuput manner. DSF is a biophysical technique that quantifies thermal stability of a protein either alone or in the context of drug-protein interaction. LOPAC® screening led to the identification of one compound able to shift the protein-ligand Tm by 7oC, eleven compounds led to the appearance of a second Tm higher than that of the protein alone, while five compounds were found to reduce Tm even up to a difference of 18oC, suggesting a possible interaction and/or non-specific binding. Furthermore, the results of the molecular docking calculations support our hypothesis that the 12 compounds, which caused an increase in the Tm of this specific mutation, bind near the amino acid Cys111 (Pocket 1), an area critical to aggregation kinetics of the protein and important due to its involvement in covalent interactions with other compounds capable of stabilizing the protein. In the second approach, an initial evaluation of selected cyclic peptides that previously emerged from the application of an engineered bacterial platform was performed. In this platform, combinatorial libraries of cyclic heptapeptides are biosynthesized inside E. coli cells and simultaneously screened for their ability to inhibit SOD1(A4V) aggregation. In this system approximately 192 million different cyclic heptapeptides comprising of the twenty natural aminoacids were produced and evaluated in a high-throughput manner in order to identify molecules that are able to prevent the aggregation of the pathogenic SOD1(A4V) variant. Compounds emerged from forementioned screening approaches, were retested in secondary in vitro low-throughput experiments with purified SOD1(A4V) produced from E. coli cells. The subsequent experiments were designed to have as a read-out the inhibition of SOD1 aggregation and specifically kinetic experiments of SOD1 with and without the selected compounds and monitor if the addition of each compound is able to rescue the aggregation pathway. The ability to reduce amyloidogenic aggregation was monitored with ThT, which is an amyloidogenic dye able to shift its fluorescence upon binding on β-sheet structures, characteristic of amyloid (or amyloid-like) formation. In addition, by use of Dynamic Light Scattering (DLS), the distribution of SOD1 different aggregation species was assessed, giving us an idea on the size of the generated aggregates. Heptapeptides P1 and P2 caused statistically significant reduction of ThT staining implying possible inhibition of SOD1(A4V) aggregation or formation of structures that are more amorphous rather than having amyloid component. Subsequent DLS experiments monitoring SOD1(A4V) size distribution suggest that possibly those two peptides may act as modulators of SOD1 aggregation rather than inhibitors. The mechanism of their action could be further deciphered and validated by experiments using cells or small animal models, since in general in vitro techniques can not predict the effect of the differentiation of the pathogenesis pathways induced by the presence of the peptides.

Η Cu/Zn δισμουτάση του υπεροξειδίου (SOD1) είναι ένα ομοδιμερές ένζυμο που εκφράζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και καταλύει την αντίδραση μετατροπής των ριζών υπεροξειδίου O2- σε O2 και H2O2. Πρόκειται για ένα μεταλλοένζυμο που περιέχει χαλκό χάρη στον οποίο επιτυγχάνεται η οξειδοαναγωγική του δράση, ψευδάργυρο που σταθεροποιεί τη διαμόρφωση του διμερούς και έναν ενδομοριακό δισουλφιδικό δεσμό. Μεταλλάξεις στη SOD1 έχουν συσχετιστεί με την αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), μια πολύ σοβαρή και ανίατη νευροεκφυλιστική ασθένεια των κινητικών νευρώνων, η οποία εξελίσσεται ταχέως και οδηγεί στο θάνατο 3-5 χρόνια μετά την αρχική διάγνωση. Κάποιες μεταλλάξεις σχετίζονται με μείωση της δραστηριότητας του ενζύμου, αλλά η τοξική τους δράση στα νευρικά κύτταρα προκαλείται μέσω ενός μηχανισμού πρόσδοσης νέας λειτουργίας (gain of function): διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν μεταλλαγμένη SOD1 αναπτύσσουν συμπτώματα της νόσου, ενώ σε ποντίκια που έχει γίνει διαγραφή του γονιδίου που την κωδικοποιεί, αυτά δεν είναι επιρρεπή σε απώλεια κινητικών νευρώνων. Ο μηχανισμός με τον οποίο οι μεταλλάξεις της SOD1 προκαλούν επιλεκτικό θάνατο των νευρικών κυττάρων δεν έχει αποσαφηνιστεί ακόμα, ωστόσο η παρουσία τους σχετίζεται με: μειωμένη ενεργότητα ενζύμου, αλλαγές στη λειτουργία των μεταφορέων γλουταμικού που σχετίζονται με γλουταμική τοξικότητα εκ διεγέρσεως, διατάραξη της ομοιόστασης του χαλκού και αυξημένη τάση της πρωτεΐνης για λανθασμένη αναδίπλωση και συνακόλουθη συσσωμάτωση, μηχανισμός στον οποίο εστιάζει η παρούσα διατριβή. Ουβικιτυλιωμένα πρωτεΐνικά συσσωματώματα που περιέχουν SOD1 στο κυτταρόπλασμα των κινητικών νευρώνων αποτελούν αδιαμφισβήτητο εύρημα και χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου. Η παρούσα εργασία περιγράφει την πορεία ανακάλυψης ενώσεων ως αναστολείς συσσωμάτωσης της SOD1 που φέρει τη μεταλλαγή A4V, με πιθανή θεραπευτική δράση έναντι της ALS, χρησιμοποιώντας δύο προσεγγίσεις. Στην πρώτη προσέγγιση πραγματοποιήθηκε in vitro σάρωση μιας χαρακτηρισμένης βιβλιοθήκης 1280 φαρμακολογικά ενεργών ενώσεων, της LOPAC®. Κάθε ένωση αξιολογήθηκε ως προς την ικανότητά της να αυξάνει τη θερμική σταθερότητα της SOD1(A4V) με την τεχνική φθορισμομετρίας διαφορικής σάρωσης (DSF). Η DSF είναι μια βιοφυσική τεχνική που ποσοτικοποιεί τη θερμική σταθερότητα μιας πρωτεΐνης εξάγοντας τη θερμοκρασία τήξης (Tm) της είτε μόνης της είτε στο πλαίσιο αλληλεπίδρασης φαρμάκου-πρωτεΐνης. H υπόθεση εργασίας είναι ότι ενώσεις που αυξάνουν την Tm, σημαίνει ότι προσδένονται στη φυσικη της διαμόρφωση και τη σταθεροποιούν, οπότε είναι πιθανό να καθυστερούν ή να αναστέλλουν τη συσσωμάτωσή της. Τελικά, εντοπίστηκε μια ένωση ικανή να μετατοπίσει την Tm της πρωτεΐνης κατά 7oC, έντεκα ενώσεις οδήγησαν στην εμφάνιση δεύτερης Tm μεγαλύτερης από αυτό της πρωτεΐνης, ενώ πέντε ενώσεις βρέθηκαν να μειώνουν την Tm μέχρι 18oC, υποδηλώνοντας πιθανή αλληλεπίδραση ή/και μη ειδική πρόσδεση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των υπολογισμών μοριακής πρόσδεσης υποστηρίζουν την υπόθεσή μας ότι οι 12 ενώσεις, που προκάλεσαν αύξηση του Tm της συγκεκριμένης μεταλλαγής, προσδένονται κοντά στο αμινοξύ Cys111 (Pocket 1) μια περιοχή, κρίσιμης σημασίας στην κινητική συσσωμάτωσης, και λόγω της συμμετοχής της σε ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις με άλλες ενώσεις ικανές να σταθεροποιούν την πρωτεΐνη. Στη δεύτερη προσέγγιση, πραγματοποιήθηκε αρχική αξιολόγηση επιλεγμένων κυκλικών μορίων που είχαν προηγουμένως προκύψει από την εφαρμογή βακτηριακής πλατφόρμας όπου συνδυαστικές βιβλιοθήκες κυκλικών επταπεπτιδίων βιοσυντίθενται μέσα σε κύτταρα Escherichia coli και ταυτόχρονα αξιολογούνται για την ικανότητά τους να αναστέλλουν τη συσσωμάτωση της SOD1(A4V). Στο σύστημα αυτό, είχαν παραχθεί περίπου 192 εκατομμύρια διαφορετικά κυκλικά επταπεπτίδια αποτελούμενα από τα είκοσι φυσικά αμινοξέα, τα οποία και αξιολογήθηκαν μέσω συστήματος σάρωσης υψηλής απόδοσης για τον εντοπισμό μορίων που αποτρέπουν τη συσσωμάτωση της παθογόνου παραλλαγής SOD1(A4V). Επιλεγμένα μόρια που προέκυψαν από τις προαναφερθείσες προσεγγίσεις επανεξετάστηκαν σε δευτερεύοντα in vitro πειράματα χρησιμοποιώντας απομονωμένη SOD1(A4V) που παράγεται από κύτταρα E. coli. Συγκεκριμένα, με πειράματα κινητικής συσσωμάτωσης της SOD1(A4V) παρουσία και απουσία των ενώσεων αυτών παραρακολουθήθηκε εάν η προσθήκη κάθε ένωσης είναι ικανή να αναστέλλει ή να τροποποιεί τη συσσωμάτωση. Η ικανότητα μείωσης της αμυλοειδογόνου συσσωμάτωσης αξιολογήθηκε με χρώση θειοφλαβίνης Τ (ThT), η οποία είναι μια χρωστική ικανή να φθορίζει κατά τη δέσμευση της σε δομές β-φύλλου, χαρακτηριστικό του σχηματισμού αμυλοειδούς (ή τύπου αμυλοειδούς). Επιπλέον, με τη χρήση της τεχνικής Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS) παρακολουθήθηκε η κατανομή των διαφορετικών ειδών συσσωματωμάτων της SOD1, δίνοντάς μας μια ιδέα για το μέγεθος των δομών που σχηματίζονται. Τα επταπεπτίδια P1 και P2 προκάλεσαν στατιστικά σημαντική μείωση της χρώσης ThT υποδηλώνοντας πιθανή αναστολή της συσσωμάτωσης SOD1(A4V) ή σχηματισμό δομών που είναι πιο άμορφες ή που στις οποίες έχει μειωθεί η συνιστώσα αμυλοειδογονικότητας. Στη συνέχεια , πειράματα με χρήση DLS επέδειξαν ότι το μέγεθος των δομών που σχηματίζονται κατά την κινητική συσσωμάτωσης της SOD1(A4V) είναι όμοιο με αυτό απουσία πεπτιδίων, υποδηλώνοντας ότι πιθανώς αυτά τα δύο πεπτίδια δρουν ως ρυθμιστές της συσσωμάτωσης SOD1 παρά ως αναστολείς της. Ο αναλυτικός μηχανισμός της δράσης τους μπορεί να αποκρυπτογραφηθεί περαιτέρω και να επικυρωθεί με in vivo πειράματα χρησιμοποιώντας κύτταρα ή μοντέλα μικρών ζώων, καθώς γενικά οι in vitro τεχνικές δεν μπορούν να προβλέψουν το αποτέλεσμα της διαφοροποίησης των οδών παθογένεσης που προκαλείται από την παρουσία των πεπτιδίων.