High-pressure liquid chromatography coupled to post-column derivatization: development of novel analytical methods and modes

Abstract

The present thesis is divided into three parts. The first part includes the development and validation of two analytical methods using the classic high-pressure liquid chromatography – post-column derivatization (HPLC-PCD) approach, while the second and third parts include the introduction of new instrument modes based on this technique. The developed methods, using the classic technique, were focused on the determination of the biogenic amine histamine and its precursor histidine in food samples and the determination of glutathione and its disulfide in a single run. Selective reaction systems were applied in both works giving reliable results and satisfactory analytical figures of merit. The new instrument modes that were developed, under the names HPLC-Pulsed-PCD and HPLC-ZF-PCD approaches, were based on the introduction of well-defined zones of microliter levels of the reagents into the flowing stream in contrast to the continuous flow needed in the classic technique. Thus, the consumption of the reagents and the wastes were dramatically reduced through the new approaches. The zone of the reagents is injected into the flowing stream after precise synchronization with the eluted compound, to form the derivative. The HPLC-Pulsed-PCD was applied using four different chemical systems and for the determination of closely eluted compounds. Also, it was used for the application of an expensive reagent for the first time in flowing conditions. The approach HPLC-ZF-PCD was introduced, for the first time, in order to deliver different reagent zones for the determination of analytes using different chemical conditions. This eliminates a second disadvantage of the classic technique that requires only the use of one chemical system and thus compromisation of the conditions is usually needed.

Η παρούσα διατριβή χωρίζεται σε τρία μέρη. Το πρώτο μέρος περιλαμβάνει την ανάπτυξη και επικύρωση δύο αναλυτικών μεθόδων με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης σε συνδυασμό με παραγωγοποίηση μετά τη στήλη (HPLC-PCD), ενώ το δεύτερο και το τρίτο μέρος περιλαμβάνουν την εισαγωγή καινοτόμων οργανολογικών διατάξεων στην HPLC-PCD. Οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν, χρησιμοποιώντας HPLC-PCD, περιλάμβαναν τον προσδιορισμό της βιογενούς αμίνης ισταμίνης και της πρόδρομης ένωσής της, ιστιδίνη, σε δείγματα τροφίμων, καθώς και στον προσδιορισμό της γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της σε μία μέτρηση. Εκλεκτικά χημικά συστήματα εφαρμόστηκαν και στις δύο εργασίες δίνοντας αξιόπιστα αποτελέσματα και ικανοποιητικά αναλυτικά χαρακτηρίστηκα. Οι καινοτόμες οργανολογικές διατάξεις, HPLC-Pulsed-PCD και HPLC-ZF-PCD, βασίστηκαν στην εισαγωγή καθορισμένης ζώνης αντιδραστηρίων στο ρέον ρεύμα, σε επιπέδο μικρολίτρων, σε αντίθεση με τη συνεχή ροή που απαιτείται στο κλασική τεχνική. Έτσι, η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και των παραγόμενων αποβλήτων μειώθηκε δραματικά. Η ζώνη των αντιδραστηρίων εγχέεται στο ρέον μετά από ακριβή συγχρονισμό με την εκλουόμενη ένωση, για να σχηματιστεί το παράγωγο. Το σύστημα HPLC-Pulsed-PCD εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας τέσσερα διαφορετικά χημικά συστήματα καθώς και για τον προσδιορισμό κοντινών εκλουόμενων ενώσεων. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε για την εφαρμογή ενός ακριβού αντιδραστηρίου για πρώτη φορά σε συνθήκες ροής. Το σύστημα HPLC-ZF-PCD αναπτύχθηκε με σκοπό την προώθηση διαφορετικών ζωνών αντιδραστηρίων για τον προσδιορισμό ενώσεων χρησιμοποιώντας διαφορετικές χημικές συνθήκες. Αυτό εξαλείφει ένα δεύτερο μειονέκτημα της κλασικής τεχνικής που απαιτεί τη χρήση μόνο ενός χημικού συστήματος και συμβιβασμό των συνθηκών αντίδρασης.