Κατασκευή και μελέτη νέων μικρό-αναλυτικών συσκευών χάρτου για τον ποσοτικό προσδιορισμό βιοχημικών ουσιών με τη χρήση φορητών ηλεκτρονικών συσκευών

Abstract

Microfluidic paper-based analytical devices (μPADs) have received enormous attention through the years because they are simple, inexpensive and portable and they can be used as analytical platforms at the point of need (e.g., environment, food quality) and at the point of care (diagnostic devices), especially in laboratories with limited resources or areas with limited access to medical facilities. Furthermore, the ability to control the flow rate in hydrophilic channels can be used to automate multistep assays, which will ultimately allow the development of improved diagnostics devices. The objective of the present Thesis is the fabrication and application of paper-based analytical devices for the determination of biochemical substances in biological samples and in nutritional supplements. In one of the methods, the control of the flow rate was also studied. The devices are composed of chromatographic paper and wax barriers and all methods offered easy detection using portable imaging devices. The intensity of the recorded color or the fluorescence (which is proportional to the concentration of the analyte) was measured in RGB mode by using ImageJ program at the computer. Specifically, in the first experimental work of the thesis, a new method for controlling fluid transport rate on paper-based devices that enables both the delay and the acceleration of fluid flow is proposed. The delays were incorporated by wax printing linear patterns of variable width within the flow channel and melted to penetrate the paper. The acceleration of flow was accomplished by overlaying hydrophobic stripes on the hydrophilic path. As a proof of concept, an enzymatic assay of glucose was used. In the second experimental work, a direct fluorimetric method, employing paper-based devices for the selective determination of histidine is described. The suggested method exploits the fluorescence emission of histidine after its rapid reaction with o-phthalaldehyde at a basic medium on the surface of a paper device with the application of a UV lamp at 354 nm. The user has to add the sample, illuminate the device and read the fluorescence of the sensing area using a simple imaging device (cell-phone camera). This analytical procedure was optimized, validated and applied successfully in random urine samples. In the third experimental work, a rapid and facile method for the colorimetric determination of calcium using paper-based devices was developed. The proposed method utilizes the color differences developing, after the addition of calcium, on the surface of the devices because of the complexation reaction of calcium with Methylthymol Blue (MTB) in alkaline pH. A flatbed scanner was used as a detector and the method was optimized, validated and successfully applied to saliva samples. In the fourth experimental work, a new, direct paper-based fluorimetric method is described for the quantitative determination of glutathione molecules in nutritional supplements. The proposed analytical method is based on the fluorescence emission resulting from the direct and selective chemical reaction of glutathione molecules with the derivatization reagent (o-phthalaldehyde) in alkaline pH. Then, the various parameters were optimized; the method was validated and applied to three different samples.

Η ανάγκη για εκτέλεση δοκιμών στο σημείο ανάγκης (π.χ. περιβάλλον, ποιότητα τροφίμων) και για ανάπτυξη οικονομικά αποδοτικών διαγνωστικών τεστ στο σημείο φροντίδας συνεχώς αυξάνεται ειδικά για εργαστήρια με περιορισμένους πόρους και περιοχές με περιορισμένη πρόσβαση σε ιατρικές μονάδες. Οι μικρο-αναλυτικές συσκευές χάρτου (μPADs) αποτελούν τα τελευταία χρόνια ιδανική επιλογή για την κάλυψη αυτών των αναγκών λόγω της απλότητάς τους, του χαμηλού κόστους και της φορητότητας που προσφέρουν. Επιπλέον, η ικανότητα ελέγχου του ρυθμού ροής στα υδρόφιλα κανάλια μπορεί να αξιοποιηθεί για την αυτοματοποίηση των αναλύσεων πολλαπλών βημάτων, οι οποίες τελικά θα επιτρέψουν την ανάπτυξη βελτιωμένων διαγνωστικών συσκευών. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή έγινε κατασκευή μικρο-αναλυτικών συσκευών χάρτου και εφαρμογή τους για τον προσδιορισμό τεσσάρων βιοχημικών ουσιών σε βιολογικά δείγματα και φαρμακευτικά σκευάσματα. Παράλληλα, σε μία από τις μεθόδους μελετήθηκε ο έλεγχος της ταχύτητας της ροής του υγρού. Οι συσκευές αποτελούνταν από χαρτί χρωματογραφίας και κερί και όλες οι μέθοδοι προσέφεραν εύκολη ανίχνευση με τη χρήση φορητών ηλεκτρονικών συσκευών όπως η κάμερα ενός smartphone ή ένας επίπεδος σαρωτής. Με την βοήθεια ενός λογισμικού επεξεργασίας εικόνων έγινε μετατροπή της έντασης είτε του καταγεγραμμένου χρώματος είτε του φθορισμού (η οποία είναι ανάλογη της συγκέντρωσης) σε πληροφορίες τιμών ενός χρωματικού μοντέλου όπως είναι το RGB (κόκκινο, πράσινο, μπλε). Πιο συγκεκριμένα, στην πρώτη πειραματική εργασία της διατριβής, διερευνάται μια καινούρια μέθοδος ελέγχου της ροής του ρευστού που επιτρέπει τόσο την επιβράδυνση όσο και την επιτάχυνση. Οι υστερήσεις πραγματοποιήθηκαν με την εκτύπωση γραμμικών μοτίβων με κερί μεταβλητού πλάτους εντός του καναλιού ροής τα οποία θερμάνθηκαν για να διεισδύσουν στο χαρτί. Η επιτάχυνση της ροής επιτεύχθηκε με την επικάλυψη της υδρόφιλης διαδρομής από υδρόφοβα στρώματα. Για την εφαρμογή της ιδέας, χρησιμοποιήθηκε ένας ενζυμικός προσδιορισμός γλυκόζης. Στην δεύτερη πειραματική εργασία, περιγράφεται μια άμεση φθορισμομετρική μέθοδος, που χρησιμοποιεί συσκευές χάρτου για τον εκλεκτικό προσδιορισμό της ιστιδίνης. Η προτεινόμενη μέθοδος εκμεταλλεύεται την εκπομπή φθορισμού της ιστιδίνης μετά την ταχεία αντίδρασή της με ο-φθαλαλδεΰδη (OPA) σε βασικό περιβάλλον στην επιφάνεια της συσκευής με την εφαρμογή λάμπας UV στα 354 nm. Ουσιαστικά γίνεται προσθήκη δείγματος, ακτινοβόληση της συσκευής με την λάμπα και μέτρηση του φθορισμού χρησιμοποιώντας μια κάμερα ενός smartphone. Τέλος, έγινε βελτιστοποίηση, επικύρωση και εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα ανθρώπινων ούρων με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Στην τρίτη πειραματική εργασία, αναπτύχθηκε μια γρήγορη και εύκολη μέθοδος για τον χρωματομετρικό προσδιορισμό του ασβεστίου χρησιμοποιώντας τις ίδιες συσκευές χάρτου. Ουσιαστικά, αξιοποιούνται οι χρωματικές διαφορές που αναπτύσσονται, μετά την προσθήκη ασβεστίου, στην επιφάνεια των συσκευών λόγω της αντίδρασης συμπλοκοποίησης του ασβεστίου με το μπλε της μεθυλθυμόλης (MTB) σε αλκαλικό pH. Ένας επίπεδος σαρωτής χρησιμοποιήθηκε σαν ανιχνευτής και ακολούθησε βελτιστοποίηση, επικύρωση και επιτυχής εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα σιέλου. Στην τελευταία πειραματική εργασία, περιγράφεται μια φθορισμομετρική μέθοδος με βάση το χαρτί για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μορίων γλουταθειόνης σε συμπληρώματα διατροφής. Η μέθοδος βασίζεται στην εκπομπή φθορισμού που προκύπτει από την άμεση και εκλεκτική χημική αντίδραση των μορίων γλουταθειόνης με το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης που είναι η ο-φθαλαλδεΰδη σε αλκαλικές συνθήκες. Έπειτα, βελτιστοποιήθηκαν οι διάφορες παράμετροι, έγινε επικύρωση και εφαρμογή της μεθόδου σε τρία διαφορετικά δείγματα συμπληρωμάτων διατροφής.