Ο ρόλος των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων των ιστονών και της μεθυλίωσης του DNA στον καρκίνο της ωοθήκης

Abstract

Introduction: Despite recent advances in the treatment of epithelial ovarian cancer, recurrence and mortality rates have not significantly improved. In recent years, DNA methylation has been strongly linked to carcino-genesis in experimental models and nearly all types of human cancer. Technological advancements have also led to the identification of methylation sites on key histone residues, lysine and arginine. DNA hypermethylation in ovarian cancer has generally been associated with poor prognosis and chemo-resistance, but the exact role of DNA methyltransferases (DNMTs) has not been fully explored. Additionally, abnormal expression or dysfunction of lysine methyltransferases (KMTs) and arginine methyl-transferases (PRMTs) has been observed in cancer, where specific enzymes may play a role in promoting or suppressing its progression. Methods: In the current study, we used information from online databases (TNMplot, Gepia2, Kaplan Meier plot-ter, cProsite) regarding the gene expression levels of DNMTs, KMTs, and PRMTs in ovarian cancer. We also studied the immunohistochemical expression of DNMTs (DNMT1, 2, 3A, 3B, and 3L), EZH2, and PRMT1 and CARM1/PRMT4 in 108 primary (serous and mucinous) tumors and 26 recurrences. Results: RNA-seq data showed that mRNA levels of DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, and DNMT3L were higher and DNMT2 levels were lower in cancers compared to normal tissue. Also, the expression of DNMT3A and DNMT2 decreased from Stage II to Stage IV. Proteomic data also suggested that protein levels of DNMT1 and DNMT3A were increased in tumors. In immunohistochemical analysis, DNMT1, DNMT3A, and DNMT3L expression was observed to be increased while DNMT2 expression was decreased in high-grade carcinomas compared to non-neoplastic tissue and low-grade carcinomas. Additionally, DNMT1 and DNMT3L were increased in relapses compared to primary tumors. In KMplotter, mRNA levels of DNMT3A and DNMT3B were negatively correlated with overall survival. Regarding KMTs, RNA-seq data showed that most KMTs at the H3K9 site (such as HSUV39H1, SUV39H2, G9A, and SETDB1) as well as EZH2 (H3K27 site) and NSD2 (H3K36 site) are increased in serous ovarian carcinoma compared to nor-mal ovarian tissue. Conversely, expression of most KMTs at the H3K4 site (MLL1/KMT2a, MLL4/KMT2D, SMYD1, SMYD3) at the H3K36 site (NSD3, ASH1, SETD2) and DOT1L (H3K79) is decreased in cancer cells. HKMTs SETD8 and SUV420H1 (H4K20) were significantly overexpressed in metastases compared to pri-mary tumors. According to cProsite, protein expression of EHMT2/G9a (H3K9 site) is increased in can-cer, while expression of KMT2A, KMT2B, and SETD7 (H3K4 site) is decreased. Immunohistochemical analysis of EZH2 revealed that high-grade tumors showed the highest levels of EZH2 expression com-pared to other serous subtypes. According to KMplotter, high expression of KMTs H3K4, H3K36, and H3K79 is associated with shorter survival. Regarding PRMTs, mRNA and protein levels of PRMT1, PRMT4/CARM1, PRMT5, and PRMT6 are increased in cancers compared to normal tissue, while mRNA expression of PRMTs 2, 7, 8, and 9 is markedly decreased. Immunohistochemical study showed statisti-cally significant cytoplasmic overexpression of PRMT1 and CARM1 markers in high-grade carcinomas. Additionally, cytoplasmic PRMT1 expression was increased in FIGO stage 3 tumors, as well as in relapses compared to primary tumors. Conclusions: DNMT1 and DNMT3L are overexpressed in primary high-grade serous ovarian carcinomas and increase further in recurrences, while DNMT3A is overexpressed only in the early stages of cancer progression. The decreased expression of DNMT2 highlights its presumed tumor-suppressive action in ovarian can-cer. Our research highlighted varied activity of KMTs in serous ovarian carcinoma, mainly indicating overexpression of KMTs acting on H3K9 and H3K79 (EZH2) sites and a decrease in H3K4, H3K36, which are associated with poor prognosis. PRMT1, PRMT3, PRMT4/CARM1, PRMT5, and PRMT6 are overex-pressed in ovarian cancer, while the cytoplasmic localization of PRMT1 and CARM1 enzymes mediates the development of high-grade serous carcinomas.

Εισαγωγή: Παρά τις πρόσφατες προόδους στη θεραπεία του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών, τα ποσοστά υποτροπής και θνησιμότητας δεν έχουν βελτιωθεί σημαντικά. Τα τελευταία χρόνια η μεθυλίωση του DNA έχει ισχυρά συνδεθεί με την καρκινογένεση σε πειραματικά μοντέλα και σχεδόν σε όλους τους τύπους καρκίνου στον άνθρωπο. Πρόσφατα, η τεχνολογική πρόοδος οδήγησε επίσης στον εντοπισμό θέσεων μεθυλίωσης στα βασικά κατάλοιπα των ιστονών λυσίνη και αργινίνη. Η υπερμεθυλίωση του DNA στον καρκίνο της ωοθήκης έχει γενικά συσχετιστεί με δυσοίωνη πρόγνωση και ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία, αλλά ο ακριβής ρόλος των DNA μεθυλοτρανσφερασών (DNMTs) δεν έχει πλήρως διερευνηθεί. Επίσης, ανώμαλη έκφραση ή δυσλειτουργία των μεθυλοτρανφερασών της λυσίνης (ΗΚΜΤs) και αργινίνης (PRMTs) έχει παρατηρηθεί στον καρκίνο των ωοθηκών, στα πλαίσια του οποίου, συγκεκριμένα ένζυμα ενδέχεται να διαδραματίζουν ρόλο στην προώθηση ή την καταστολή της εξέλιξης αυτού. Μέθοδοι: Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε πληροφορίες από διαδικτυακές βάσεις δεδομένων (ΤΝΜplot, Gepia2, Kaplan Meier plotter, cProsite) που αναφέρονταν στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των μορίων των DNMTs, ΗΚΜΤs και PRMTs στον καρκίνο της ωοθήκης. Επίσης, μελετήσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση των DNMTs (DNMT1, 2, 3A, 3B και 3L), της EZH2 και των PRMT1 και CARM1/PRMT4 σε 108 πρωτοπαθείς (ορώδεις και βλεννώδεις) όγκους και 26 υποτροπές. Αποτελέσματα: Τα δεδομένα RNA-seq κατέδειξαν ότι τα επίπεδα mRNA των DNMT1, DNMT3A, DNMT3B και DNMT3L ήταν υψηλότερα και της DNMT2 ήταν χαμηλότερα στους καρκίνους σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό. Επίσης, η έκφραση των DNMT3A και DNMT2 μειώθηκε από το Στάδιο II έως το Στάδιο IV. Τα πρωτεομικά δεδομένα υποδήλωσαν επίσης ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης των DNMT1 και DNMT3A ήταν αυξημένα στους όγκους. Στην ανοσοϊστοχημική ανάλυση η έκφραση των DNMT1, DNMT3A και DNMT3L παρατηρήθηκε αυξημένη ενώ η έκφραση της DNMT2 μειωμένη στα υψηλού βαθμού καρκινώματα σε σύγκριση με τον μη νεοπλασματικό ιστό και τα χαμηλού βαθμού καρκινώματα. Επιπλέον, οι DNMT1 και DNMT3L ήταν αυξημένες στις υποτροπές σε σύγκριση με τους πρωτοπαθείς όγκους. Στο ΚΜplotter τα επίπεδα mRNA των DNMT3A, και DNMT3B συσχετίστηκαν αρνητικά με τη συνολική επιβίωση. Όσον αφορά στις KMTs τα δεδομένα RNA-seq έδειξαν ότι οι περισσότερες ΚΜΤ της θέσης H3K9 (όπως οι HSUV39H1, SUV39H2,G 9A και SETDB1) καθώς και οι EZH2 (θέση H3K27) και NSD2 (θέση H3K36) είναι αυξημένες στο ορώδες καρκίνωμα ωοθήκης σε σύγκριση με το φυσιολογικό ωοθηκικό ιστό. Αντίθετα, η έκφραση των περισσότερων ΚΜΤs της θέσης H3K4 (MLL1/KMT2a,MLL4/KMT2D, SMYD1,SMYD3), της θέσης H3K36 (NSD3, ASH1, SETD2) και η DOT1L (H3K79), είναι μειωμένη στα καρκινικά κύτταρα. Οι ΚΜΤs SETD8 και SUV420H1 (H4K20) ήταν σημαντικά υπερέκφρασμένες στις μεταστάσεις σε σύγκριση με τους πρωτοπαθείς όγκους. Σύμφωνα με το cProsite, η πρωτεϊνική έκφραση της EHMT2/G9a (θέση H3K9) είναι αυξημένη στον καρκίνο, ενώ η έκφραση των KMT2A, KMT2B και SETD7 (θέση H3K4) είναι μειωμένη. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση του EZH2 ανέδειξε ότι οι όγκοι υψηλής κακοήθειας εμφάνισαν τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης EZH2 σε σύγκριση με άλλους ορώδεις υποτύπους. Σύμφωνα με το KMplotter, η έκφραση των ΚΜΤs H3K4, H3K36 και H3K79 συνδέεται με βραχύτερη επιβίωση. Όσον αφορά τις PRMTs, τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης των PRMT1, PRMT4/CARM1, PRMT5 και PRMT6 είναι αυξημένα στους καρκίνους σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό, ενώ η έκφραση mRNA των PRMTs 2, 7, 8 και 9 είναι σαφώς ελαττωμένη. Η ανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε στατιστικά σημαντική κυτταροπλασματική υπερέκφραση των δεικτών PRMT1 και CARM1 στους καρκίνους υψηλού βαθμού κακοήθειας. Επίσης, η κυτταροπλασματική έκφραση PRMT1 ήταν αυξημένη στους όγκους σταδίου FIGO 3, καθώς και στις υποτροπές έναντι των πρωτοπαθών όγκων. Συμπεράσματα: Οι DNMT1 και DNMT3L υπερεκφράζονται στα πρωτοπαθή υψηλής κακοήθειας ορώδη καρκινώματα ωοθήκης και αυξάνονται περαιτέρω στις υποτροπές, ενώ η DNMT3A είναι υπερεκφρασμένη μόνο στα πρώιμα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου. Η μείωση της έκφρασης της DNMT2 υπογραμμίζει την υποτιθέμενη ογκοκατασταλτική της δράση στον καρκίνο της ωοθήκης. Η αναζήτησή μας ανέδειξε ποικίλη δραστηριότητα των ΚΜΤs στο ορώδες καρκίνωμα ωοθήκης, επισημαίνοντας κατά κύριο λόγο την υπερέκφραση των ΚΜΤs που δρουν στις θέσεις H3K9 και Η3Κ79 (ΕΖΗ2) και τη μείωση των H3K4, H3K36, με τις τελευταίες να σχετίζονται με δυσμενή πρόγνωση. Οι PRMT1, PRMT3, PRMT4/CARM1, PRMT5 και PRMT6 υπερεκφράζονται στον καρκίνο της ωοθήκης ενώ η κυτταροπλασματική εντόπιση των ενζύμων PRMT1 και CARM1 διαμεσολαβεί στην ανάπτυξη των ορωδών καρκινωμάτων υψηλής κακοήθειας.