Διερεύνηση του επιγενετικού μηχανισμού επανέκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) σε ασθενείς με μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο (MDS) μετά από θεραπεία με απομεθυλιωτικό παράγοντα και αναζήτηση της προγνωστικής σημασίας της επανέκφρασης αυτής για την ανταπόκριση στη θεραπεία των ασθενών

Abstract

Background : myelodysplastic syndromes (MDS) are characterized by epigenetic modification and dysregulation, and hypomethylating agents (HMAs), decitabine (DAC) and azacytidine (AZA), remain the primary therapeutic options to prevent the progression of high-risk MDS (HR-MDS) patients, to acute myeloid leukemia (AML). Although the mechanism of action of HMAs has been extensively studied, it remains yet incompletely understood. As new treatment options emerge for patients with HR-MDS, the identification of accessible prognostic markers for the response to HMA therapy and the understanding of mechanisms, underlying their delayed and short-term responses are essential. Despite their known action against DNMT1 and DNMT3A methyltransferases, uncertainty persists regarding the prognostic value of induced hypomethylation. Data from studies on peripheral blood cells suggest that after initial hypomethylation, DNA methylation levels are restored by the end of the 28-day treatment cycle with HMAs. However, data on DNA methylation analysis from bone marrow aspirates of MDS patients using high-resolution advanced techniques are scarce in the literature. Since it is epigenetically silenced, fetal hemoglobin (HbF) induction has been proposed as a prognostic marker for patients receiving DAC. Furthermore, although epigenetic mechanisms are assumed, the methylomes of patients have not been thoroughly examined to elucidate the precise mechanism of HbF re-expression. Our aim was to clarify the kinetics and prognostic value of HbF in patients undergoing AZA treatment. Additionally, we investigated the changes in the epigenetic landscape of patients treated with HMAs at the genome-wide/chromosomal level, as well as the alterations in the methylation of HbF expression regulators following AZA treatment and their clinical significance. Results: In the cohort of patients treated with HMAs and analyzed using genome-wide methylated DNA sequencing (MeD-seq) with the restriction enzyme LpnPI (n=13), an overall increase in average chromosomal methylation was observed, along with a concurrent relative decrease in specific regions, primarily involving non-coding RNAs, among responders (n=6) at the end of six or more HMA treatment cycles. In contrast, non-responders (n=7) exhibited hypomethylation across most chromosomes, which did not lead to an improvement in their clinical phenotype but might instead, have promoted disease progression, as seen in other cancer types. However, chromosomes 21, X, and Y were notably hypermethylated. Serial HbF measurements using high-performance liquid chromatography (n=20) showed HbF induction only among AZA responders (p=0.030). Furthermore, HbF increase immediately after the first AZA treatment cycle demonstrated prognostic value for progression-free survival (PFS) (p=0.032, HR=0.19, CI:0.24-1.63). In AZA-treated patients, changes in methylation patterns were revealed through MeD-seq analysis (n=7) for the genes FOG-1, RCOR-1, ZBTB7A, and genes encoding subunits of the NuRD complex. Targeted pyrosequencing methodology (n=28) revealed a strong inverse correlation between the methylation status of the γ-globin gene (HBG2) promoter and baseline HbF levels (p=0.003, rs=-0.663). A potential epigenetic mechanism of HbF re-expression in AZA responders was highlighted by targeted methylation analysis, showing hypomethylation of the -53 site of the HBG2 promoter (p=0.039, rs=-0.504), which corresponds to the MBD2-NuRD binding site, as well as hypermethylation of the CpG326 island of ZBTB7A (p=0.05, rs=0.482); a known HbF repressor. These changes were associated with blast cell clearance in the bone marrow (pHBG2=0.011, rs=0.480 / pZBTB7A=0.026, rs=0.427) and demonstrated prognostic value for PFS (pZBTB7A=0.037, HR=1.14, CI:0.34-3.8). Reduction of ZBTB7A expression in leukemic cell lines (TF1, MV4-11) showed a tendency to decrease their proliferation, although without a reduction in clonogenicity or sensitivity to AZA. Treatment with low-dose AZA in differentiating to erythroid TF1 cells did indeed show an increase in HBG2 expression along with a simultaneous decrease in ZBTB7A. Conclusions: Response to HMAs appears to be associated with patterns of average hypermethylation at the chromosomal level after at least six treatment cycles, with their demethylating effect targeting specific genomic regions, including non-coding RNAs. In contrast, overall hypomethylation is observed in non-responding patients across most chromosomes, except for chromosomes 21, X, and Y, which are strongly hypermethylated. Early HbF induction emerges as an accessible prognostic marker for HMA therapy, and the proposed epigenetic mechanism of HbF re-expression in AZA responders involves hypomethylation of the γ-globin gene promoter and hypermethylation of the CpG326 regulatory island of ZBTB7A. The correlation of these methylation patterns with blast cell clearance and their prognostic value for PFS, along with the chromosomal-level methylation changes based on treatment response, pave the way for a deeper exploration of the epigenetic mechanism of action of HMAs.

Εισαγωγή : τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) χαρακτηρίζονται από επιγενετική απορρύθμιση και οι απομεθυλιωτικοί παράγοντες (HMAs), δεσιταμπίνη (DAC) και αζακυτιδίνη (AZA), είναι έως και σήμερα η κύρια θεραπευτική επιλογή για την αναχαίτηση της εξέλιξης των υψηλού κινδύνου ΜΔΣ (HR-MDS) σε οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ). Αν και ο ακριβής τρόπος δράσης των HMA έχει μελετηθεί συστηματικά και σε βάθος, ωστόσο δεν είναι απόλυτα σαφής έως και σήμερα. Καθώς αναδύονται νέες θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με HR-MDS, η αναγνώριση εύκολα αποκτώμενων προγνωστικών δεικτών για την ανταπόκριση στη θεραπεία με HMA και η κατανόηση των μηχανισμών των καθυστερημένων και βραχυπρόθεσμων ανταποκρίσεών τους είναι απαραίτητη. Παρά την γνωστή δράση τους έναντι των μεθυλτρανσφερασών DNMT1 και DNMT3A, παραμένει αβεβαιότητα σχετικά με την προγνωστική αξία της επαγωγής υπομεθυλίωσης στο γονιδίωμα. Στοιχεία από τις έως τώρα μελέτες σε κύτταρα περιφερικού αίματος έχουν δείξει επαναφορά των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA στο τέλος του κύκλου των 28 ημερών θεραπείας με HMA, μετά την αρχική υπομεθυλίωση, ενώ δεδομένα ανάλυσης της μεθυλίωσης του DNA από μυελικά αναρροφήματα ασθενών με ΜΔΣ με υψηλής ευκρίνειας νεότερες τεχνικές είναι πενιχρά στην βιβλιογραφία. Λόγω της επιγενετικής τροποποίησης και αποσιώπησης της έκφρασης των γ-γονιδίων της αιμοσφαιρίνης, η επαγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) έχει προταθεί ως προγνωστικός δείκτης για ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με DAC. Επιπλέον, αν και υπήρχε σοβαρή υποψία ότι επιγενετικοί μηχανισμοί εμπλέκονται, τα μεθυλιώματα των ασθενών με ΜΔΣ δεν έχουν εξεταστεί διεξοδικά για να προσεγγίσουν τον μηχανισμό της επανέκφρασής της. Στόχος μας αυτής της διατριβής ήταν να διευκρινιστεί η κινητική της HbF και η προγνωστική της αξία σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με AZA. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι μεταβολές του επιγενετικού τοπίου των ασθενών που λαμβάνουν HMA σε επίπεδο ολικού γονιδιώματος/χρωμοσωμάτων, αλλά και οι αλλαγές στην μεθυλίωση ρυθμιστών έκφρασης της HbF μετά από θεραπεία με AZA, καθώς και η κλινική τους σημασία. Αποτελέσματα: Στο σύνολο των ασθενών που έλαβαν HMA και αναλύθηκαν με αλληλούχιση DNA επόμενης γενιάς για την ανίσχνευση μεθυλίωσης σε επίπεδο γονιδιώματος (MeD-seq), χρησιμοποιώντας το περιοριστικό ένζυμο LpnPI (n=13), φάνηκε η συνολική αύξηση της μέσης μεθυλίωσης σε επίπεδο χρωμοσωμάτων με ταυτόχρονη σχετική μείωση της σε συγκεκριμένες περιοχές, που αφορούν κυρίως μη-κωδικά RNA, στους ανταποκριθέντες ασθενείς (n=6), στο τέλος έξι ή περισσότερων κύκλων HMA. Αντίθετα, στους μη ανταποκριθέντες ασθενείς (n=7) καταγράφηκε υπομεθυλίωση στα περισσότερα χρωμοσώματα, η οποία όμως δεν οδήγησε σε βελτίωση του κλινικού τους φαινοτύπου, αλλά πιθανώς να προήγαγε την εξέλιξη της νόσου, όπως παρατηρείται και σε άλλους τύπους νεοπλασμάτων, με εξαίρεση τα χρωμοσώματα 21, Χ, και Y τα οποία ήταν έντονα υπερμεθυλιωμένα. Οι διαδοχικές μετρήσεις της HbF με χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (n=20) έδειξαν επαγωγή της HbF μόνο μεταξύ των ασθενών που ανταποκρίθηκαν στην AZA (p=0.030). Επιπλέον, η αύξηση των επιπέδων της HbF, αμέσως μετά τον πρώτο κύκλο θεραπείας με ΑΖΑ διαπιστώθηκε να έχει προγνωστική αξία για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) (p=0.032, HR=0.19, CI:0.24-1.63). Επιπλέον, σε ασθενείς που έλαβαν ΑΖΑ, με ανάλυση MeD-seq (n=7) αποκαλύφθηκαν αλλαγές στα πρότυπα μεθυλίωσης για τα γονίδια FOG-1, RCOR-1, ZBTB7A καθώς και για γονίδια των υπομονάδων του συμπλόκου NuRD. Η στοχευμένη μέθοδος πυροαλληλούχισης (pyrosequencing) (n=28) αποκάλυψε ισχυρή ανάστροφη συσχέτιση μεταξύ του βαθμού μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου της γ-αλυσίδας (HBG2) και των αρχικών επιπέδων της HbF (p=0.003, rs=-0.663). Με την ίδια μέθοδο αναδείχθηκε ένας πιθανός επιγενετικός μηχανισμός επανέκφρασης της HbF στους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν στην AZA, μέσω υπομεθυλίωσης της θέσης -53 του υποκινητή του HBG2 (p=0.039, rs=-0.504), η οποία αντιστοιχεί στη θέση σύνδεσης MBD2-NuRD, καθώς και υπερμεθυλίωσης της νησίδας CpG326 του ZBTB7A (p=0.05, rs=0.482), ενός γνωστού καταστολέα της HbF. Αξιοσημείωτο είναι ότι αυτές οι μεταβολές συσχετίστηκαν με την κάθαρση των βλαστικών κυττάρων (pHBG2=0.011, rs=0.480 / pZBTB7A=0.026, rs=0.427) και έδειξαν προγνωστική αξία για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (pZBTB7A=0.037, HR=1.14, CI:0.34-3.8). Η μείωση της έκφρασης του ZBTB7A σε λευχαιμικές κυτταρικές σειρές (TF1, MV4-11) έδειξε τάση μείωσης του πολλαπλασιασμού τους, χωρίς ωστόσο μείωση της κλωνογονικότητας ή της ευαισθησίας τους στην AZA. Η θεραπεία με μικρή δόση AZA σε ωριμάζοντα προς ερυθροκύτταρα, κύτταρα της σειράς TF1 έδειξε πράγματι την αύξηση της έκφρασης του HBG2, με ταυτόχρονη μείωση της έκφρασης του ZBTB7A. Συμπεράσματα: Η ανταπόκριση στους HMA φαίνεται να σχετίζεται με μοτίβα μέσης υπερμεθυλίωσης σε επίπεδο χρωμοσωμάτων στο τέλος τουλάχιστον 6 κύκλων θεραπείας και η υπομεθυλιωτική δράση τους αφορά συγκεκριμένες γονιδιωματικές περιοχές, που συμπεριλαμβάνουν μη-κωδικά RNA. Αντίθετα, συνολική υπομεθυλίωση παρατηρείται σε μη ανταποκριθέντες ασθενείς στα περισσότερα χρωμοσώματα, με εξαίρεση τα χρωμοσώματα 21, Χ, και Y που υπερμεθυλιώνονται έντονα. Η πρώιμη επαγωγή της HbF αναδεικνύεται ως ένας εύκολα προσβάσιμος προγνωστικός δείκτης για τη θεραπεία με HMA, και ο προτεινόμενος επιγενετικός μηχανισμός επανέκφρασης της HbF σε ασθενείς που ανταποκρίνονται στην AZA περιλαμβάνει την υπομεθυλίωση του υποικινητή του γονιδίου της γ-αλυσίδας και την υπερμεθυλίωση της ρυθμιστικής νησίδας CpG326 του ZBTB7A. Η συσχέτιση αυτών των προτύπων μεθυλίωσης με την κάθαρση των βλαστικών κυττάρων στο μυελό και η προγνωστική τους αξία για το PFS, καθώς και τα μοτίβα μεταβολής της μεθυλίωσης σε επίπεδο χρωμοσωμάτων ανάλογα με την ανταπόκριση στην θεραπεία, ανοίγουν τον δρόμο για μια βαθύτερη συζήτηση σχετικά με τον επιγενετικό μηχανισμό δράσης των HMA.