Identification of the signal transduction pathways activated by pulsatile GnRH to optimally stimulate FSHβ at low GnRH pulse frequencies and at low GnRHR levels

Abstract

The hypothalamic decapeptide, gonadotropin-releasing hormone (GnRH), is the key neuroendocrine regulator of mammalian reproductive development and function. Activation of specific, high affinity cell surface receptors (GnRHR) on gonadotropes by GnRH triggers signal transduction cascades to stimulate the coordinated synthesis and secretion of the gonadotropins, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH). These hormones, in turn, stimulate gonadal function, to direct gonadal steroidogenesis and gametogenesis, making their regulation essential for sexual maturation and reproductive health. GnRH is released in pulsatile manner and variations in frequency and amplitude differentially affect FSH and LH synthesis and release. FSH is preferentially stimulated at low GnRH pulse frequencies, whereas LH is preferentially stimulated at high GnRH pulse frequencies. The mechanism by which the gonadotrope “decodes” GnRH pulse frequency to differentially control FSH and LH has not been fully elucidated.The GnRHR is a G protein-coupled receptor that canonically activates Gαq/11-dependent signaling upon ligand binding. However, the receptor can also couple to Gαs and in vitro data suggest that toggling between different G proteins may contribute to GnRH pulse frequency decoding. This study aims to identify the signal transduction pathways activated through the GnRHR at varying GnRH pulse frequencies and determine the role of cell surface GnRHR levels in dictating these pathways. Two transcription factors, cAMP-response element-binding protein (CREB) and inducible cAMP early repressor (ICER), have been implicated in the regulation of Fshb gene expression. Early growth response protein (Egr1) is a key factor in regulating Lhb expression after pulsatile GnRH stimulation. We hypothesize that GnRHR couples to Gαs at low GnRHR levels and at low GnRH pulse frequencies, leading to increases in PKA activity, phosphorylation of CREB, and hence activation of FSHβ transcription and FSH production and secretion. Conversely, we hypothesize that at high GnRH pulse frequencies, GnRHR couples to Gαq/11 leading to phosphorylation of ERK, induction of Egr1 to activate LHβ transcription and LH production and secretion, and induction of ICER to reduce activation of FSHβ transcription and FSH production and secretion. In the present study, we showed that knockdown of Gαs impairs GnRH-stimulated FSH synthesis at low, but not high pulse frequency in a model gonadotrope-derived cell line. The induction of pCREB levels was also reduced only at low GnRH pulse frequency, with a loss of the GnRH pulse frequency-dependent pattern, while Icer expression was not affected by Gαs depletion. On the other hand, the knockdown of Gαq/11 KD cells, led to a reduced induction of Fshb and Icer expression after GnRH stimulation at both high- and low-pulse frequencies. Furthermore, the induction of pERK1/2 levels was reduced at both GnRH pulse frequencies. Taken together, these data indicate that a Gαs-mediated signaling pathway mediates GnRH activation of CREB at low-pulse frequencies, while a Gαq/11-mediated pathway led to activation of ICER contributing to the decoding of the pulsatile GnRH to regulate Fshb gene expression in vitro.We next used a Cre-lox conditional knockout approach to interrogate the relative roles of Gαq/11 and Gαs proteins in gonadotrope function in vivo. Gonadotrope-specific Gαq/11 knockouts exhibit hypogonadotropic hypogonadism and infertility, akin to the phenotypes seen in GnRH- or GnRHR-deficient mice. In contrast, under standard conditions, gonadotrope-specific Gαs knockouts produce gonadotropins at normal levels and are fertile. However, the LH surge amplitude is blunted in Gαs knockout females and post-gonadectomy increases in FSH and LH are reduced in both males and females. These data suggest that GnRH may signal principally via Gαq/11 to stimulate gonadotropin production, but that Gαs plays important roles in gonadotrope function in vivo when GnRH secretion is enhanced.

Η εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών (GnRH), είναι ο βασικός νευροενδοκρινικός ρυθμιστής της αναπαραγωγικής ανάπτυξης και λειτουργίας των θηλαστικών. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων (GnRHR) στη κυτταρική επιφάνεια των γοναδοτρόπων κύτταρων από την GnRH πυροδοτεί καταρράκτες μεταγωγής σήματος που οδηγούν στη συντονισμένη σύνθεση και έκκριση των γοναδοτροπινών, της θυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) και της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH). Αυτές οι ορμόνες, με τη σειρά τους, διεγείρουν τη λειτουργία των γονάδων, για να κατευθύνουν τη στεροειδογένεση και τη γαμετογένεση, καθιστώντας τη ρύθμισή τους απαραίτητη για τη σεξουαλική ωρίμανση και την αναπαραγωγική λειτουργία. Η GnRH απελευθερώνεται με παλμικό τρόπο και οι διακυμάνσεις στη συχνότητα της επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη σύνθεση και την απελευθέρωση της FSH και της LH. Η FSH διεγείρεται κατά προτίμηση σε χαμηλές συχνότητες παλμών GnRH, ενώ η LH διεγείρεται κατά προτίμηση σε υψηλές συχνότητες παλμών GnRH. Ο μηχανισμός με τον οποίο τα γοναδοτρόπα κύτταρα «αποκωδικοποιούν» τη συχνότητα παλμού της GnRH για να συντονίσουν την σύνθεση και παραγωγή της FSH και της LH δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως.Ο υποδοχέας GnRHR είναι ένας συζευγμένος με πρωτεΐνη G υποδοχέας που ενεργοποιεί το εξαρτώμενο από Gαq/11 σηματοδοτικό μονοπάτι μετά την πρόσδεση της GnRH. Ωστόσο, μπορεί επίσης να συζευχθεί και με την πρωτείνη Gαs. Η εναλλαγή μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών G μπορεί εν δυνάμει να συμβάλει στην αποκωδικοποίηση της συχνότητας παλμών GnRH. Αυτή η μελέτη στοχεύει να αναγνωρίσει τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται μέσω του GnRHR από διαφορετικές συχνότητες παλμών GnRH και να προσδιορίσει το ρόλο του αριθμού υποδοχέων GnRHR στην κυτταρική επιφάνεια στην διέγερση αυτών των μονοπατιών. Δύο μεταγραφικοί παράγοντες, η πρωτεΐνη που δεσμεύει το στοιχείο απόκρισης cAMP (CREB) και ο επαγόμενος πρώιμος καταστολέας της cAMP (ICER), έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου Fshb. Η πρωτεΐνη πρώιμης απόκρισης ανάπτυξης (Egr1) είναι ένας βασικός παράγοντας στη ρύθμιση της έκφρασης Lhb μετά από παλμική διέγερση GnRH. Υποθέτουμε ότι ο GnRHR συνδέεται με την Gαs σε χαμηλά επίπεδα GnRHR και σε χαμηλές συχνότητες παλμών GnRH, οδηγώντας σε αυξήσεις στη δραστηριότητα της φωσφορικής κινάσης Α (PKA), σε φωσφορυλίωση της CREB και ως εκ τούτου ενεργοποίηση της μεταγραφής FSHβ και παραγωγής και έκκρισης FSH. Αντίθετα, υποθέτουμε ότι σε υψηλές συχνότητες παλμών GnRH, ο GnRHR συνδέεται με την Gαq/11 που οδηγεί σε φωσφορυλίωση της κινάσης ERK, επαγωγή του Egr1 για να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή LHβ και την παραγωγή και έκκριση LH και επαγωγή του ICER για μείωση της μεταγραφής και κατεπέκταση σύνθεση της FSHβ.Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε in vitro, ότι η απενεργοποίηση της Gαs μειώνει τη σύνθεση FSH που διεγείρεται από GnRH σε χαμηλή, αλλά σε όχι υψηλή συχνότητα παλμών. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του CREB μειώθηκαν επίσης μόνο στη χαμηλή συχνότητα παλμού GnRH, με απώλεια του μοτίβου εκλεκτικής διέγερσης από παλμούς GnRH. Η μεταγραφή του Icer δεν επηρεάστηκε. Αντίθετα, η απενεργοποίηση της Gαq/11, οδήγησε σε μειωμένη επαγωγή της έκφρασης Fshb και Icer μετά από διέγερση με GnRH σε συχνότητες υψηλών και χαμηλών παλμών. Επιπλέον, η επαγωγή των επιπέδων φωσφορυλίωσης pERK1/2 μειώθηκε και στις δύο συχνότητες παλμών GnRH. Συμπερασματικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ένα επαγώμενο από την Gαs σηματοδοκοτικό μονοπάτι μεσολαβεί στην φωσφορυλίωση του CREB έπειτα από διέγερση από χαμηλής συχνότητας παλμούς GnRH. Αντίθετα ένα επαγώμενο από την Gαq/11 σηματοδοκοτικό μονοπάτι οδήγησε στην μεταγραφή και μετάφραση του ICER. Πιθανά αυτά τα δύο μονοπάτια συνδράμουν στην αποκωδικοποίηση των παλμών GnRH προς ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου Fshb in vitro.Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση νοκ-άουτ με τη μέθοδο Cre-lox για να διερευνήσουμε τους σχετικούς ρόλους των πρωτεϊνών Gαq/11 και Gαs στη λειτουργία των γοναδοτρόπων in vivo. Οι διαγονιδιακόι ποντικοί Gαq/11 cKO παρουσιάζουν υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό και στειρότητα, παρόμοια με τους φαινοτύπους που παρατηρούνται σε διαγονιδιακούς ποντικούς με έλλειψη GnRH ή GnRHR. Αντίθετα, οι διαγονιδιακοί ποντικοί Gαs cKO παράγουν γοναδοτροπίνες σε φυσιολογικά επίπεδα και έχουν φυσιολογική αναπαραγωγική λειτουργία. Ωστόσο μετά τη γοναδεκτομή (συνθήκες υψηλής συχνότητας GnRH παλμών) δεν παρατηρήθηκε η προσδοκόμενη αύξηση των επιπέδων FSH και LH. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η GnRH μπορεί να σηματοδοτεί κυρίως μέσω του Gαq/11 για τη διέγερση της παραγωγής γοναδοτροπινών, αλλά και η Gαs παίζει σημαντικό ρόλο στη λειτουργία των γοναδοτρόπων in vivo, ιδίως όταν η συχνότητα έκκρισης GnRH αυξάνεται.