Defining the mechanism of action of CHUK/ΙΚΚα kinase and additional lung-specific protein kinases in lung cancer

Abstract

Lung cancer is the leading cause of cancer deaths worldwide and the second most common type of cancer. Despite the development of new therapies, such as immunotherapies and KRAS inhibitors, the survival rates remain low. Lung cancer is histologically divided into small- (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC). The most common type of NSCLC is lung adenocarcinoma (LUAD), which makes up to 70% of the cases. Several signalling pathways are dysregulated in LUAD, including the canonical and non-canonical NF-κB pathways. The NF-κB signalling pathways are the main regulators of inflammation, and their aberrant activation in cancer promotes cell survival, cell proliferation, migration and angiogenesis. The upstream effector of the pathway, IKKα has pleiotropic effects in cancer acting as a tumour promoter or a tumour suppressor, in a tissue specific way. NSCLC often confers loss or downregulation of tumour suppressor kinases, including LKB1, LATS1/2 and IKKα. Previous research has shown that IKKα is a tumour suppressor in lung adenocarcinoma, where IKKα ablation results in decreased cell senescence and promotes a highly immunosuppressive TME. In addition, IKKα ablation promotes the activation of the hypoxia factor HIF-1α, and its target genes, facilitating carcinogenesis under the in vivo hypoxic conditions.The aim of this study was to identify novel roles of IKKα and characterise their mechanisms accounting for IKKα’s tumour suppressor activity in lung cancer. To accomplish this, we first employed a co-immunoprecipitation mass spectrometry analysis, to determine the IKKα protein interactome in LUAD cells. This analysis identified several novel protein partners, including splicing factors, mRNA transport and mRNA surveillance proteins. We focused our next experiments on the interaction between IKKα and the ATP-dependent RNA helicase eIF4A3. eIF4A3 is a core component of the Exon Junction Complex that regulates RNA splicing, mRNA transport to the nucleus and nonsense-mediated mRNA decay. eIF4A3 is often found elevated in cancer and facilities carcinogenesis through the regulation of RNA splicing, ribosome biogenesis and autophagy. IKKα mainly interacts with eIF4A3 in the nucleus, while this interaction is independent of its kinase function. In addition, an in vitro kinase assay showed that IKKα does not phosphorylate eIF4A3. Since IKKα was found to interact with multiple splicing factors, deep RNA-sequencing was performed to study the alternative splicing in IKKα depleted cell lines. The analysis identified global isoform expression changes with intron retention being more prominent, as well as an enrichment in ribosomal subunit alternative isoforms. Cancer progression is characterised by the dysregulation of alternative splicing, further promoting the hallmarks of cancer by silencing the expression of tumour suppressor genes or by enhancing the expression or function of tumour promoters. Novel transcripts were also identified that could serve as neoantigens and be targeted for therapy.eIF4A3 also regulates ribosome biogenesis, which is often upregulated in cancer to supplement the increased need for protein synthesis and cell proliferation. We performed various ribosome biogenesis assays to study the role of IKKα in the different processes. Dysregulation of rRNA transcription and processing was found in IKKαKO cells, while global translation was elevated in these cell lines. Under nucleolar stress, IKKα depleted cells had reduced p53 and p21 activation. Furthermore, we found IKKαKO cells to be more resistant to cell death upon treatment with chemotherapeutic drugs. Finally, our whole proteomics analysis of IKKαKO cells revealed an upregulation in many metabolic pathways and the glutathione pathway, while there was a downregulation in proteins involved in RNA splicing, ribosome and rRNA processing. Overall, we identified novel protein interactors of IKKα in LUAD cell lines, that play a role in splicing and mRNA metabolism. Through these interactions, IKKα regulates alternative splicing of target genes, while it also affects ribosome biogenesis and translation. Through these functions, IKKα may play a role in protecting LUAD cells from chemotherapy resistance, acting as a tumour suppressor in lung cancer. Therefore, these findings support a novel function of IKKα in RNA splicing that can affect gene expression and protein function.

Ο καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο και είναι ο δεύτερος συχνότερος τύπος καρκίνου παγκοσμίως. Παρά την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, όπως οι ανοσοθεραπείες και οι φαρμακολογικοί αναστολείς της ογκοπρωτεΐνης KRAS, τα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης παραμένουν χαμηλά. Κλινικά διαχωρίζεται σε μικροκυτταρικό (SCLC) και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ο πιο συχνά εμφανιζόμενος τύπος NSCLC (70%) αποτελεί το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LUAD). Η ανάπτυξη του LUAD προάγεται μέσω της απορρύθμισης διαφόρων σηματοδοτικών πορειών, μεταξύ των οποίων και οι σηματοδοτικές πορείες του NF-κB. Οι σηματοδοτικές πορείες του NF-κB ρυθμίζουν την φλεγμονώδη αντίδραση, ενώ η ανεξέλεγκτη ενεργοποίηση τους σε καρκινικά κύτταρα προάγει διαδικασίες όπως η κυτταρική επιβίωση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση και η αγγειογένεση. Η κινάση ΙΚΚα είναι βασικός ρυθμιστής των σηματοδοτικών πορειών του NF-κB και παρουσιάζει πλειοτροπική δράση στον καρκίνο, λειτουργώντας ως ογκογόνα ή ογκοκατασταλτική πρωτεϊνη σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Ο καρκίνος του πνεύμονα συχνά χαρακτηρίζεται από απώλεια ή μειορύθμιση ογκοκασταλτικών κινασών, όπως οι κινάσες LKB1, LATS1/2 και ΙΚΚα. Συγκεκρίμενα, η ΙΚΚα έχει ογκοκατασταλτικό ρόλο στον καρκίνο του πνεύμονα, καθώς η απαλοιφή της προάγει ένα ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον του όγκου, και καταστέλλει την κυτταρική γήρανση. Επιπλέον, η απαλοιφή της ΙΚΚα προάγει την ενεργοποίηση του παράγοντα υποξίας HIF-1α και την έκφραση των γονιδίων στόχων του, προωθώντας την ανάπτυξη του όγκου σε συνθήκες υποξίας.Στόχος της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η εύρεση νέων ογκοκατασταλτικών μηχανισμών δράσης της ΙΚΚα στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LUAD). Αρχικά, πραγματοποιήθηκε συν-ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την ΙΚΚα, και ακολούθησε ανάλυση τους μέσω φασματομετρίας μάζας. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων κατέδειξε εμπλουτισμό σε πρωτεΐνες που συμμετέχουν στις διαδικασίες ματίσματος και μεταβολισμού του mRNA. Συγκεκριμένα, η ΙΚΚα αλληλεπιδρά με την ATP-εξαρτώμενη RNA ελικάση eIF4A3. Η eIF4A3 συμμετέχει στο σύμπλοκο exon junction complex (EJC), όπου ρυθμίζει το σωστό μάτισμα mRNA, τη μεταφορά των mRNA στο κυτταρόπλασμα και την αποικοδόμηση τους μέσω της πορείας nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Η πρωτεΐνη αυτή εμφανίζει ογκογόνες δράσεις σε διάφορους τύπους καρκίνου, μέσω της ρύθμισης των μηχανισμών του ματίσματος, της ριβοσωμικής βιογένεσης και της αυτοφαγίας, ενώ συχνά υπερεκφράζεται σε καρκινικούς ιστούς. Η πρωτεϊνική αλληλεπίδραση ΙΚΚα-eIF4A3 λαμβάνει μέρος κυρίως στον πυρήνα, ενώ η δράση κινάσης της ΙΚΚα δεν είναι αναγκαία για την δημιουργία της αλληλεπίδρασης. Επιπλέον, μέσω δοκιμασιών δράσης κινάσης in vitro, δεν βρέθηκε πιθανή φωσφορυλίωση της eIF4A3 από την ΙΚΚα. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό του μηχανισμού δράσης της ΙΚΚα στη ρύθμιση του ματίσματος του RNA, πραγματοποιήθηκε βαθιά αλληλούχιση RNA από κυτταρικές σειρές ΙΚΚαKO. Ο NSCLC χαρακτηρίζεται από αυξημένα ποσοστά εναλλακτικού ματίσματος, ενώ η δυσλειτουργία των μηχανισμών του ματίσματος εμπλέκεται στην ανάπτυξη του. Η ανάλυση του μεταγραφώματος ταυτοποίησε εναλλακτικές ισομορφές διαφόρων γονιδίων, με εμπλουτισμό σε γονίδια που κωδικοποιούν ριβοσωμικές υπομονάδες. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκαν νέες μη-χαρακτηρισμένες αλληλουχίες mRNAs, οι οποίες θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως νεοαντιγονικοί στόχοι.Ένας επιπλέον ρόλος της πρωτεΐνης eIF4A3 είναι η ρύθμιση της ριβοσωμικής βιογένεσης. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν αυξημένες απαιτήσεις για τη σύνθεση πρωτεϊνών, καθώς ο ρυθμός πολλαπλασιασμού τους είναι υψηλός. Για το λόγο αυτό, η βιογένεση των ριβοσωμάτων είναι επίσης αυξημένη στα καρκινικά κύτταρα. Μέσω δοκιμασιών ριβοσωμικής βιογένεσης, δείξαμε πως οι κυτταρικές σειρές ΙΚΚαΚΟ παρουσιάζουν υψηλότερα ποσοστά μετάφρασης, ενώ η έκφραση και ωρίμανση των διαφορετικών rRNAs βρέθηκε απορυθμισμένη. Έπειτα από την αναστολή της ριβοσωμικής βιογένεσης μέσω στρεσογόντων παραγόντων, παρατηρήθηκε μειωμένη ενεργοποίηση των p53 και p21. Εν συνέχεια, οι κυτταρικές σειρές ΙΚΚαΚΟ παρουσίασαν αυξημένη χημειοανθεκτικότητα έπειτα από τη χορήγηση χημειοθεραπευτικών. Τέλος, πρωτεομική ανάλυση φασματομετρίας μάζας ολικών εκχυλισμάτων κυττάρων ΙΚΚαΚΟ κατέδειξε την αυξημένη έκφραση πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε μεταβολικά μονοπάτια και στο μεταβολισμό της γλουταθειόνης, ενώ παρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση ριβοσωμικών πρωτεϊνών και πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μάτισμα και στην ωρίμανση των rRNAs. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή καταδεικνύει ένα νέο ογκοκατασταλτικό μηχανισμό της κινάσης ΙΚΚα μέσω της αλληλεπίδρασης και ρύθμισης πρωτεϊνών του συμπλόκου EJC, και συγκεκριμένα την ελικάση eIF4A3, συμβάλλοντας έτσι στη ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος και της ριβοσωμικής βιογένεσης. Μέσω των λειτουργειών αυτών, η ΙΚΚα πιθανώς ρυθμίζει αρνητικά τη δημιουργία αντίστασης στη χημειοθεραπεία στο NSCLC. Συνεπώς, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν έναν νέο ρόλο της IKKα στο μάτισμα του RNA που μπορεί να επηρεάσει την έκφραση γονιδίων και τη λειτουργία πρωτεϊνών.