Investigation of marine organisms and microorganisms for the discovery of novel bioactive natural products

Abstract

The world's oceans harbor an immense diversity of life, offering a largely untapped reservoir of bioactive compounds with potential applications in medicine, cosmetics, and biotechnology. The exploration of marine ecosystems for novel biomolecules presents both opportunities and challenges, necessitating innovative approaches to overcome existing bottlenecks. This PhD thesis investigates various strategies for the discovery and sustainable exploitation of marine-derived compounds, presenting findings from different approaches. Chapter 1 outlines the TASCMAR project, an H2020 EU-funded initiative aimed to unlock the potential of marine ecosystems. Over 260 marine invertebrates from the euphotic and unexplored mesophotic zone of the Indian Ocean, the Red Sea, and the Mediterranean Sea were collected, alongside more than 300 microorganisms isolated from these invertebrates. Optimized extraction protocols resulted in the creation of two extensive libraries: MACLIB, comprising 189 invertebrate extracts, and MICLIB, containing 1208 symbiont extracts. Biological activity screening revealed promising anti-aging properties for both libraries. In cell-free assays, 5.29% of MACLIB extracts inhibited elastase, 5.29% suppressed tyrosinase, and 3.17% downregulated proteasome activity. Corresponding results for the MICLIB library were 2.07% for elastase inhibition, 7.37% for tyrosinase inhibition and 0.41% for proteasome inhibition. Subsequent cell assays identified six extracts with anti-elastase activity, two with anti-tyrosinase activity, and six as potent proteasome inhibitors. Chapter 2 focuses on the metabolic characterization of the extract XML-192 from the MACLIB library, utilizing UHPLC-HRMS/MS. This extract derived from the Mediterranean sponge Crambe crambe, a well-known model organism recognized for its high concentrations of pharmacologically significant metabolites. Through a comprehensive deconvolution approach, 53 compounds were annotated, belonging to the crambescin and crambescidin families. Notably, among these, 22 crambescin analogues were reported for the first time. Chapter 3 addresses the challenge of environmentally friendly exploitation of marine bioresources by presenting a novel technology that combines external water circulation with solid-phase extraction. This method was validated in an aquarium setting and successfully applied to elicit guanidine alkaloid production in a Crambe crambe sponge in the presence of sea anemone, Anemonia sulcata. This proof of concept led to the isolation, among others, of three new guanidine alkaloids: one carboxylated analog of crambescidin 359 named crambescidin 401 and two analogs of crambescin B, crambescin B 281 and crambescin B 253. Lastly, Chapter 4 explores the bioactive compounds from two marine-associated microorganisms, Cladosporium halotolerans and Streptomyces lopnurensis. The extracts of these microorganisms, XMlm-133-S2-L-AE and XMLm-113-S3-L-M, respectively, demonstrated notable anti-elastase and anti-tyrosinase activity, respectively, during the high-throughput screening in Chapter 1. Through mass culture and in-situ solid-phase extraction, eighteen compounds, predominantly diketopiperazines and bile acids, were isolated. All compounds were tested for their enzymatic inhibitory activities in cell-based assays, focusing on anti-aging and anticancer properties. Several compounds demonstrated significant bioactivity, with three diketopiperazines and one bile acid displaying regulatory effects on multiple targets. Furthermore, one diketopiperazine and the amino acid tryptophan emerged as proteasome activators, whereas three diketopiperazines and two bile acids were found to downregulate the proteasome.

Οι ωκεανοί του κόσμου φιλοξενούν μια τεράστια ποικιλομορφία ζωής, προσφέροντας σε μεγάλο βαθμό μια αναξιοποίητη δεξαμενή βιοδραστικών ενώσεων που έχουν πιθανές εφαρμογές στην ιατρική, τα καλλυντικά και τη βιοτεχνολογία. Η εξερεύνηση των θαλάσσιων οικοσυστημάτων για την ανακάλυψη νέων βιομορίων παρουσιάζει ευκαιρίες αλλά και προκλήσεις, απαιτώντας καινοτόμες προσεγγίσεις για να ξεπεραστούν τα υπάρχοντα εμπόδια. Η παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνά διάφορες στρατηγικές για την ανακάλυψη και τη βιώσιμη εκμετάλλευση των θαλάσσιων ενώσεων, παρουσιάζοντας ευρήματα από διαφορετικές προσεγγίσεις. Το Κεφάλαιο 1 περιγράφει το έργο TASCMAR, μια πρωτοβουλία στο πλαίσιο του “Horizon 2020” που χρηματοδοτήθηκε από την ΕΕ με στόχο να ξεκλειδώσει τις δυνατότητες των θαλάσσιων οικοσυστημάτων. Πάνω από 260 θαλάσσια ασπόνδυλα συλλέχθηκαν από την ευφωτική και ανεξερεύνητη μεσοφωτική ζώνη του Ινδικού Ωκεανού, της Ερυθράς Θάλασσας και της Μεσογείου Θάλασσας, μαζί με περισσότερους από 300 μικροοργανισμούς που απομονώθηκαν από αυτά τα ασπόνδυλα. Βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα εκχύλισης χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία δύο εκτεταμένων βιβλιοθηκών: την MACLIB, που περιλαμβάνει 189 εκχυλίσματα ασπόνδυλων, και την MICLIB, που περιέχει 1208 εκχυλίσματα συμβιωτικών μικροοργανισμών. Ο έλεγχος βιολογικής δράσης ανέδειξε πολλά υποσχόμενες αντιγηραντικές ιδιότητες και για τις δύο βιβλιοθήκες. Σε ενζυμικές βιολογικές δοκιμές, το 5,29% των εκχυλισμάτων MACLIB έδειξαν αναστολή της ελαστάση, το 5,29% κατέστειλαν την τυροσινάση και το 3,17% ανέστειλαν τη δραστηριότητα πρωτεασώματος. Τα αντίστοιχα αποτελέσματα για τη βιβλιοθήκη MICLIB ήταν 2,07% για την αναστολή της ελαστάσης, 7,37% για την αναστολή της τυροσινάσης και 0,41% για την αναστολή του πρωτεασώματος. Οι βιολογικές δοκιμές που ακολούθησαν σε κυτταρικές σειρές στους επιλεγμένους στόχους ταυτοποίησαν έξι εκχυλίσματα με δράση κατά της ελαστάσης, δύο με δράση κατά της τυροσινάσης και έξι ως ισχυρούς αναστολείς πρωτεασώματος. Το Κεφάλαιο 2 εστιάζει στον χαρακτηρισμό του μεταβολικού προφίλ του εκχυλίσματος XML-192 από τη βιβλιοθήκη MACLIB, μέσω UHPLC-HRMS/MS. Το εκχύλισμα προήλθε από το μεσογειακό σπόγγο Crambe crambe, έναν πρότυπο οργανισμό που είναι ευρέως γνωστός για τις υψηλές συγκεντρώσεις του σε μεταβολίτες με σημαντική φαρμακολογική δράση. Εφαρμόστηκε μια ολοκληρωμένη προσέγγιση αποσυνέλιξης, και σχολιάστηκαν 53 ενώσεις, που ανήκουν στις οικογένειες crambescin και crambescidin. Αξιοσημείωτο είναι ότι, μεταξύ αυτών, 22 ανάλογα crambescin αναφέρθηκαν για πρώτη φορά. Στο Κεφάλαιο 3 αντιμετωπίζεται η πρόκληση της φιλικής προς το περιβάλλον εκμετάλλευσης των θαλάσσιων βιοπόρων παρουσιάζοντας μια νέα τεχνολογία που συνδυάζει την εξωτερική κυκλοφορία του νερού με την εκχύλιση στερεής φάσης. Η μέθοδος αυτή επαληθεύτηκε σε περιβάλλον ενυδρείου και εφαρμόστηκε με επιτυχία εντοπίζοντας την παραγωγή αλκαλοειδών γουανιδίνης από έναν σπόγγο Crambe crambe υπό την παρουσία της θαλάσσιας ανεμώνης Anemonia sulcata. Αυτή η απόδειξη της ορθότητας της ιδέας οδήγησε παράλληλα και στην απομόνωση, μεταξύ άλλων, τριών νέων αλκαλοειδών γουανιδίνης: ένα καρβοξυλιωμένο ανάλογο της crambescidin 359 που ονομάζεται crambescidin 401 και δύο ανάλογα της crambescin B, crambescin B 281 και crambescin B 253. Τέλος, στο Κεφάλαιο 4 διερευνώνται οι βιοδραστικές ενώσεις από δύο θαλάσσιους μικροοργανισμούς, τους Cladosporium halotolerans και Streptomyces lopnurensis. Κατά τη γρήγορη βιολογική αξιολόγηση που παρουσιάστηκε στο Κεφάλαιο 1, τα εκχυλίσματα αυτών των μικροοργανισμών κατέδειξαν αξιοσημείωτη δράση έναντι της ελαστάσης και της τυροσινάσης, αντίστοιχα. Μέσω μαζικής καλλιέργειας και εκχύλισης στερεάς φάσης in situ, απομονώθηκαν δεκαοκτώ ενώσεις, κυρίως δικετοπιπεραζίνες και χολικά οξέα. Όλες οι ενώσεις δοκιμάστηκαν για την ενζυμική ανασταλτική τους δράση σε κυτταρικές σειρές, εστιάζοντας στις αντιγηραντικές και τις αντικαρκινικές ιδιότητες. Αρκετές ενώσεις επέδειξαν σημαντική βιοδραστικότητα, με τρεις δικετοπιπεραζίνες και ένα χολικό οξύ να εμφανίζουν ρυθμιστική δράση σε πολλαπλούς στόχους. Επιπλέον, μια δικετοπιπεραζίνη και το αμινοξύ τρυπτοφάνη αναδείχθηκαν ως ενεργοποιητές πρωτεασώματος, ενώ τρεις δικετοπιπεραζίνες και δύο χολικά οξέα βρέθηκε ότι καταστέλλουν το πρωτεάσωμα.