Ο ρόλος των miRNAs που ενέχονται στη ρύθμιση της ανοσολογικής απάντησης στην εκτίμηση της έκβασης ασθενών με καρκίνο μαστού

Abstract

The role of miRNAs that are involved in regulating the immune response to the assessment of the clinical outcome of patients with breast cancer. 1. Introduction: Breast cancer (BC) is the leading cause of cancer-related morbidity and 2nd cause of death among women. Following surgical excision, women with early breast cancer receive adjuvant systemic therapy with or without local radiotherapy, but despite treatment, a significant proportion of them will develop metastases, which is the main cause of death. The immunoediting concept, which describes the dynamic relation between cancer and the immune system, is based on three stages: elimination, equilibrium, and escape. The elimination phase refers to the attack of innate and adaptive immune cell types to eradicate cancer cells; cancer cells that survived immune destruction may then enter the equilibrium phase where immunoediting occurs. The escape phase represents the final phase of the process, where immunologically shaped tumors may grow aggressively, become clinically apparent, and establish an immunosuppressive tumor microenvironment ultimately leading to tumor progression. In all three stages, various immune cell subsets, cytokines, micro-RNAs (miRs), exosomes, and cancer cells have been shown top articipate in the process. MicroRNAs (miRNAs), a class of small non-coding RNA of approximately 20–22 nucleotides in length, play a significant role in the regulation of gene transcription, by binding to the 3ʹuntranslated region of the target mRNA. They may act either as oncogenes or tumor suppressor genes, thus regulating carcinogenesis and tumor progression. The scope of the present study is10to detect and quantitate the expression of miR-10b, miR-19a, miR-20a, miR-126 and miR-155,which regulate the interaction between cancer cells and the immune system during immunosurveillance and immune evasion in the plasma of patients with early and metastatic BC, and associate their expression with clinical outcome, with the ultimate goal of finding patients who are at high risk of relapse and would potentially benefit from additional therapeuticinterventions.2.Patients and Methods Two hundred and fifteen patients with early breast cancer who underwent surgery followed by adjuvant therapy at the Pathological Oncology Department of Heraklion University Hospital(Crete, Greece) between 2004 and 2011 participated in this study, and available plasma from the clinic records was used. Blood was collected after surgery and before the administration of adjuvant therapy. In addition, 74 patients with metastatic breast cancer (mBC) who underwent first-line chemotherapy during the same period at our institution were included. Plasma samples were obtained before starting first-line chemotherapy. 20 healthy donors participated as a control group. Total RNA was isolated using Trizol LS (Ambion Life Technologies). Quantitative real-time PCR was performed using the TaqMan miRNA Reverse Transcription kit and specific miRNA stem-loop primers. The mean expression levels for each miRNA were calculated by the 2-ΔCt method relative to the mean U6 RNA levels. Patients with miRNA expression levels equal toor above the median value were characterized as having high expression, while patients with miRNA expression levels below the median value were characterized as having low expression. The relationship between circulating miRNA expression levels and disease-free survival (DFS) oroverall survival (OS) was assessed using the Kaplan-Meier method, the log rank test (Mantel-Cox)and Cox proportional hazard regression models. To estimate the value of circulating miRNAs in predicting recurrence, ROC (receiver 8 operating characteristics) curves were constructed and the area under the curve (AUC) was calculated.113. Results: Plasma samples from 140 patients with early KM, 64 patients with metastatic KM and 20 healthy women were used for this analysis. After a median follow-up of 108.3 months, 94 patients remained disease-free and 46 of 140 patients relapsed. In patients with metastatic MS, 45 of 64were de novo metastatic and 19 were relapsed patients. Also, 31 patients had triple negative breast cancer. Demographic and clinical characteristics were similar between patients who did not relapse and those who relapsed, with the exception of the percentage of patients with tumors> 5 cm (T3), 4 or more infiltrated axillary lymph nodes, and differentiation grade III being higher in patients with relapse (p= 0.031, p < 0.001 and p=0.034 respectively).The expression levels of the 5 miRNAs were compared between patients: (i) who relapsed (n=46)and those who remained relapse-free during the entire follow-up period (n=94), (ii) with early relapse, defined as recurrence within 2 years after surgery (n=16) and those who relapsed after 2years (n=30) (iii) with late recurrence, defined as recurrence at least 5 years after surgery (n=17)and those who remained free of recurrence (n=94) (iv) with early breast cancer and metastatic breast cancer patients. Only miR-155 expression was lower in patients compared to healthy women (p = 0.023), while miR-155 and miR-10b were lower in relapsed patients compared to healthy women (p = 0.039 and p = 0.002 , respectively). MiR-155 expression in association with axillary lymph node infiltration and tumor differentiation grade demonstrated increased ability to discriminate patients who relapsed from those who remained disease-free [(area under the curve,(AUC = 0.861; p < 0.001)] . Combination of miR-19a and miR-20a expression had the highest performance in discriminating patients with early relapse (AUC = 0.816, p < 0.001). Finally, miR-10b combined with lymph node infiltration and tumor differentiation grade had the highest accuracy in discriminating patients with late recurrence (AUC = 0.971, p < 0.001). We revealed a124-miRNA panel consisting of miR-19a, miR-20a, miR-126 and miR-155 capable of distinguishing early BC from metastatic BC patients with an AUC of 0.802 (p < 0.001).Survival analysis in patients with early BC revealed that low miR-10b and miR-155 expression was associated with shorter disease-free survival (DFS, p = 0.012 and p = 0.04, respectively) compared with high expression. In addition, miR-126 expression was associated with shorter overall survival(OS; p = 0.045). In multivariate analysis, the number of infiltrated axillary lymph nodes and lowmiR-10b expression independently predicted for shorter DFS (HR: 2.538; p = 0.002 and HR: 1.943;p = 0.033, respectively), while infiltrated axillary lymph nodes with low miR-126 shorter OS (HR:3.537, p = 0.001 and HR: 2.558, p = 0.018). In the subgroup of patients with triple-negative breast cancer (TNBC), low miR-155 expression independently predicted shorter DFS (HR: 5.056, p =0.037). Accordingly, patients with metastatic BC, who had low miR-10b expression, had shorter DFS and OS compared to those with high expression (p = 0.0017 and p = 0.042, respectively). In multivariate analysis, recurrent disease and low miR-10b expression independently predicted shorter PFS (HR: 2.657; p = 0.001 and HR: 1.920; p = 0.017, respectively).4. Conclusion: Our results show that the expression of specific miRNAs involved in the immune response in plasma can predict disease relapse in early BC patients’ years before clinical detection. The successful incorporation of the investigated miRNAs into clinical practice as non-invasive circulating biomarkers could improve patient prognosis as an attempt to address the significant challenge of upscaling or de-escalating therapy according to the risk of recurrence in breast cancer patients. However, due to the small sample of patients and the multiple roles of miRNAs, this merits further evaluation in larger cohorts of patients.

Ο ρόλος των miRNAs που ενέχονται στη ρύθμιση της ανοσολογικής απάντησης στην εκτίμησητης έκβασης ασθενών με καρκίνο μαστού. 1. Εισαγωγή: O καρκίνος του μαστού (ΚΜ) αποτελεί την κύρια αιτία νόσησης και τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες. Οι ασθενείς με πρώιμο ΚΜ μετά τη χειρουργική εξαίρεση της νόσου λαμβάνουν συμπληρωματική συστηματική θεραπεία με ή χωρίς τοπική ακτινοθεραπεία, όμως παρά τη θεραπεία, ένα σημαντικό ποσοστό αυτών θα αναπτύξει μεταστάσεις οι οποίες και αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου. Η έννοια της ανοσοεπιτήρησης, η οποία περιγράφει τη δυναμική σχέση μεταξύ του καρκίνου και του ανοσοποιητικού συστήματος, βασίζεται σε τρία στάδια: εξάλειψη, ισορροπία και διαφυγή. Η φάση εξάλειψης αναφέρεται στην επίθεση των κυττάρων της έμφυτης και επίκτητης ανοσίας για την εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα που επέζησαν της ανοσολογικής καταστροφής μπορούν στη συνέχεια να εισέλθουν στη φάση ισορροπίας όπου λαμβάνει χώρα η ανοσοεπιτήρηση. Η φάση διαφυγής αντιπροσωπεύει την τελική φάση της διαδικασίας, όπου ο όγκος μπορεί να αναπτυχθεί, να γίνει πλέον κλινικά εμφανής και να δημιουργήσει ένα ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον που τελικά οδηγεί σε περαιτέρω εξάπλωση του. Και στα τρία στάδια, τα καρκινικά κύτταρα, διάφορα υποσύνολα ανοσοκυττάρων και μόρια που συμμετέχουν στην κυτταρική επικοινωνία, όπως οι κυτοκίνες και τα μικρά μη-κωδικά μόρια RNA (microRNAs; miRNAs), διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο. Τα miRNAs, μια κατηγορία μικρών μη-κωδικοποιών μορίων RNA αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Τα miRNAs λειτουργώντας είτε ως ογκογονίδια (‘oncomirs’), είτε ως ογκοκατασταλτικά γονίδια (‘anti-oncomirs’), εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάλυση και ποσοτικοποίηση της έκφρασης των miR-10b,miR-19a, miR-20a, miR-126 και miR-155 και τα οποία ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και του ανοσολογικού συστήματος κατά την ανοσοεπιτήρηση και την ανοσοδιαφυγή, στο πλάσμα ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό ΚΜ και η συσχέτιση της έκφρασης αυτών με την έκβαση των ασθενών και με τελικό σκοπό την ανεύρεση ασθενών που φέρουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής και ενδεχομένως θα ωφελούνταν από επιπρόσθετους θεραπευτικούς χειρισμούς. 2. Ασθενείς και Μέθοδοι: Στη μελέτη αυτή συμμετείχαν διακόσιοι δεκαπέντε (Ν=215) ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση ακολουθούμενη από επικουρική θεραπεία στην Παθολογική Ογκολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου (ΠαΓΝΗ) μεταξύ 2004 και 2011 και διαθέσιμο πλάσμα αυτών χρησιμοποιήθηκε από τα αρχεία της κλινικής. Δείγμα αίματος συλλέχθηκε από τις ασθενείς μετά τη χειρουργική επέμβαση και πριν από τη χορήγηση επικουρικής θεραπείας. Επιπλέον, συμπεριελήφθησαν 74 ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού (mBC) που υποβλήθηκαν σε χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής κατά την ίδια περίοδο στο ίδρυμά μας. Ελήφθησαν δείγματα πλάσματος πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας πρώτης γραμμής. 20 υγιή άτομα συμμετείχαν ως ομάδα ελέγχου. Η απομόνωση του ολικού RNA έγινε με τη χρήση Trizol LS (Ambion Life Technologies). Ακολούθως πραγματοποιήθηκε ποσοτική realtime PCR, χρησιμοποιώντας το TaqMan miRNA Reverse Transcription kit και ειδικούς για miRNA stem-loop εκκινητές (primers). Τα επίπεδα έκφρασης για κάθε miRNA υπολογίσθηκαν με την μέθοδο σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔCt χρησιμοποιώνταςτο U6 snRNA ως γονίδιο αναφοράς. Ακολούθως η διάμεση τιμή των μονάδων έκφρασης για κάθε miRNA χρησιμοποιήθηκαν ως σημειο λήψης της απόφασης (cut-off) και ασθενείς με έκφρασητου εκάστοτε miRNA ίση ή πάνω από τη διάμεση τιμή χαρακτηρίζονταν ως έχοντες υψηλή έκφραση, ενώ ασθενείς με έκφραση miRNA κάτω από τη διάμεση τιμή ως έχοντες χαμηλή έκφραση. Η σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των κυκλοφορούντων miRNA και της επιβίωσης ελεύθερης νόσου (DFS) ή της συνολικής επιβίωσης (OS) αξιολογήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier, το log rank test (Mantel-Cox) και τα μοντέλα Cox proportional hazard regression. Για την εκτίμηση της αξίας των κυκλοφορούντων miRNAs στην πρόβλεψη της υποτροπής 6 κατασκευάσθηκαν καμπύλες ROC (receiver operating characteristics) και υπολογίσθηκε η περιοχή κάτω από την καμπύλη (area under the curve, AUC). 3. Αποτελέσματα: Για την ανάλυση αυτή χρησιμοποιήθηκαν δείγματα πλάσματος από 140 ασθενείς με πρώιμο KM,64 ασθενείς με μεταστατικό KM και 20 υγιείς γυναίκες. Μετά από μια διάμεση περίοδο παρακολούθησης 108,3 μηνών, 94 ασθενείς παρέμειναν ελεύθερες νόσου και 46 από τις 140 ασθενείς υποτροπίασαν. Στις ασθενείς με μεταστατικό ΚΜ, οι 45 από τις 64 ήταν de novoμεταστατικές και οι 19 ήταν ασθενείς που υποτροπίασαν. Eπίσης, 31 ασθενείς είχαν τριπλά αρνητικό καρκίνο μαστού. Τα δημογραφικά και τα κλινικά χαρακτηριστικά ήταν παρόμοια μεταξύ των ασθενών που δεν υποτροπίασαν και αυτών που υποτροπίασαν, με εξαίρεση την αναλογία των ασθενών με όγκους> 5 εκ. (Τ3), 4 ή περισσότερους διηθημένους μασχαλιαίους λεμφαδένες και βαθμό διαφοροποίησης ΙΙΙ που ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με υποτροπή (p= 0.031, p < 0.001 καιp=0.034 αντιστοίχως). Τα επίπεδα έκφρασης των 5 miRNAs συγκρίθηκαν μεταξύ των ασθενών: (i) που υποτροπίασαν (n=46) και αυτών που παρέμειναν ελεύθεροι υποτροπής κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου παρακολούθησης (n=94), (ii) με πρώιμη υποτροπή, που ορίσθηκε ως υποτροπή εντός 2 ετών μετά το χειρουργείο (n=16) και αυτών που υποτροπίασαν μετά τα 2 χρόνια (n=30) (iii) μεόψιμη υποτροπή, που ορίσθηκε ως υποτροπή τουλάχιστον 5 έτη μετά το χειρουργείο (n=17) και αυτές που παρέμειναν χωρίς υποτροπή (n=94) (iv) με πρώιμο καρκίνο μαστού και μεταστατικό καρκίνο μαστού. Μόνο η έκφραση miR-155 ήταν χαμηλότερη σε ασθενείς σε σύγκριση με υγιείς γυναίκες (p =0,023), ενώ τα miR-155 και miR-10b ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς που παρουσίασαν υποτροπήσε σύγκριση με υγιείς γυναίκες (p = 0,039 και p = 0,002, αντίστοιχα). Η έκφραση MiR-155 σε συνδυασμό με διήθηση μασχαλιαίου λεμφαδένα και τον βαθμό διαφοροποίησης του όγκου κατέδειξε αυξημένη ικανότητα στη διάκριση των ασθενών που υποτροπίασαν από αυτές που παρέμειναν ελεύθερες νόσου [(περιοχή κάτω από την καμπύλη, (AUC = 0,861; p < 0,001)]. Συνδυασμός της έκφρασης του miR-19a και miR-20a είχε την υψηλότερη απόδοση στη διάκριση ασθενών με πρώιμη υποτροπή (AUC = 0,816, p < 0,001). Τέλος, το miR-10b σε συνδυασμό με τη διήθηση ή όχι των λεμφαδένων και τον βαθμό διαφοροποίησης του όγκου είχαν την υψηλότερη ακρίβεια στη διάκριση ασθενών με όψιμη υποτροπή (AUC = 0,971, p < 0,001). Αποκαλύψαμε ένα πάνελ 4-miRNA αποτελούμενο από miR-19a, miR-20a, miR-126 και miR-155 ικανό να διακρίνειτις ασθενείς με πρώιμο από ασθενείς με μεταστατικό ΚΜ με AUC 0,802 (p < 0,001). Η ανάλυση επιβίωσης σε ασθενείς με πρώιμο ΚΜ αποκάλυψε ότι η χαμηλή έκφραση miR-10b και miR-155 συσχετίστηκε με μικρότερη επιβίωση χωρίς νόσο (DFS, p = 0,012 και p = 0,04, αντίστοιχα) σε σύγκριση με την υψηλή έκφραση. Επιπλέον, η έκφραση miR-126 συσχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση (OS, p = 0,045). Σε πολυπαραγοντική ανάλυση, ο αριθμός των διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων και η χαμηλή έκφραση miR-10b προέβλεπαν ανεξάρτητα για μικρότερο DFS (HR: 2.538; p = 0.002 και HR: 1.943; p = 0.033, αντίστοιχα), ενώ διηθημένοι μασχαλιαίοι λεμφαδένες με χαμηλό miR-126 μικρότερο OS (HR: 3,537, p = 0,001 και HR: 2,558,p = 0,018). Στην υποομάδα ασθενών με τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού (TNBC), η χαμηλή έκφραση miR-155 προέβλεψε ανεξάρτητα για μικρότερο DFS (HR: 5,056, p = 0,037). Αντίστοιχα ασθενείς με μεταστατικό ΚΜ που είχαν χαμηλή έκφραση miR-10b ,είχαν μικρότερο DFS και OSσε σύγκριση με ασθενείς με υψηλή έκφραση (p = 0,0017 και p = 0,042, αντίστοιχα). Σε πολυπαραγοντική ανάλυση, η υποτροπιάζουσα νόσος και η χαμηλή έκφραση miR-10b προέβλεπαν ανεξάρτητα για μικρότερο PFS (HR: 2.657; p = 0.001 και HR: 1.920; p = 0.017, αντίστοιχα). 4. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση των συγκεκριμένων miRNA που ενέχονται στην ανοσολογική απάντηση στο πλάσμα μπορούν να προβλέψουν την υποτροπή της νόσου σε ασθενείς με πρώιμο ΚΜ χρόνια πριν από την κλινική ανίχνευση. Η επιτυχής ενσωμάτωση των κυκλοφορούντων miRNAs στην κλινική πρακτική ως μη επεμβατικών βιοδεικτών, θα μπορούσε να βελτιώσει την πρόγνωση των ασθενών σε μια προσπάθεια αντιμετώπισης της σημαντικής πρόκλησης της κλιμάκωσης ή αποκλιμάκωσης της θεραπείας ανάλογα με τον κίνδυνο υποτροπής σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, λόγω του μικρού δείγματος ασθενών και των πολλαπλών ρόλων των miRNAs , χρειάζεται να αξιολογηθούν σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών.