Engineering optimal culture conditions to trans-differentiate dermal fibroblasts towards tenogenic lineage

Abstract

Regenerative medicine, employing cells, biomaterials, biologically active substances, and combinations thereof as therapeutic agents, appears as a promising solution for the treatment of a wide range of medical conditions. Although their clinical use is currently limited to skin repair and regeneration procedures, dermal fibroblasts possess a unique set of biological characteristics that make them a very attractive cell population for broader regenerative applications. Consequently, dermal fibroblasts have recently been investigated for the regeneration of several tissues and organs, including the components of the musculoskeletal system. Nearly half of the musculoskeletal injuries reported annually involve tendon or ligament tissues. Although tendon tissue grafts are used extensively in the clinic, their low availability, donor-site morbidity, immune rejection, and disease transmission currently unbalance their therapeutic benefits. Several cell types, including dermal fibroblasts, have been explored for the development of tissue-engineered substitutes for tendon and ligament repair. However, the prolonged in vitro culture required to develop an implantable device, associated cost of goods, loss of native tenocyte phenotype, and lack of robust differentiation procedures currently hinder the clinical realisation of tendon tissue-engineered products. Considering that macromolecular crowding technology has the potential to substantially accelerate the development of functional tissue facsimiles, herein an in-depth analysis of human tenocyte and dermal fibroblast cultures under standard and macromolecular crowding conditions was conducted. The obtained results demonstrated high similarities between human tenocytes and dermal fibroblasts under both experimental conditions, highlighting the potential of the combination of dermal fibroblasts with macromolecular crowding for tendon tissue engineering. It was also found that macromolecular crowding not only increases and accelerates extracellular matrix deposition but also enhances haemostatic, anti-microbial, and tissue-protective activities, further de-risking macromolecular crowding technology for the accelerated development of advanced therapy medicinal products. In addition, during this study, it was detected that human tenocytes produced higher amounts of TGFB2 than dermal fibroblasts, highlighting this growth factor as a potential tool to shift the dermal fibroblast phenotype towards the tenogenic lineage. Subsequently, given the prominent role of tissue-specific microenvironments in cell fate determination and the complexity of the microenvironment to which tendon resident cells are subjected in vivo, a tendon-mimicking microenvironment was engineered in vitro by employing an anisotropic biomaterial substrate, TGFB2, and macromolecular crowding in a multifactorial approach. The potential of the engineered tendon microenvironment was evaluated for the redifferentiation of human tenocytes and the transdifferentiation of dermal fibroblasts towards the tenogenic lineage. The obtained results demonstrated the value of the selected microenvironmental cues to emulate tenogenic traits, thereby facilitating the development of an in vitro microenvironment simulating native tendon characteristics, capable of redifferentiating human tenocytes and transdifferentiating dermal fibroblasts towards the tenogenic lineage. Furthermore, this approach led to the generation of tissue-engineered constructs featuring tenogenic cells arranged in a parallel manner, embedded within a dense tendon-specific extracellular matrix, possessing an anisotropic structure. Taking into account their features, these structures could be useful not only for creating innovative tendon treatments, but also for developing tendon microphysiological systems with significance in fundamental research, disease modelling, and drug discovery.

Η αναγεννητική ιατρική, που χρησιμοποιεί κύτταρα, βιοϋλικά, βιολογικά ενεργές ουσίες και συνδυασμούς αυτών ως θεραπευτικούς παράγοντες, φαίνεται να αποτελεί υποσχόμενη λύση για τη θεραπεία ποικίλων ιατρικών καταστάσεων. Αν και η κλινική τους χρήση περιορίζεται προς το παρόν στην αναγέννηση του δέρματος, οι ινοβλάστες του δέρματος διαθέτουν μοναδικά βιολογικά χαρακτηριστικά, κάνοντάς τους ελκυστικούς για ευρύτερες αναγεννητικές εφαρμογές. Πρόσφατες μελέτες εξετάζουν τους ινοβλάστες του δέρματος για την αναγέννηση ιστών και οργάνων, περιλαμβανομένων των στοιχείων του μυοσκελετικού συστήματος. Σχεδόν οι μισοί από τους μυοσκελετικούς τραυματισμούς που αναφέρονται ετησίως αφορούν ιστούς τενόντων ή συνδέσμων. Παρόλο που τα μοσχεύματα ιστών τένοντα χρησιμοποιούνται στην κλινική, η περιορισμένη διαθεσιμότητά τους, η νοσηρότητα του σημείου δότη και οι κίνδυνοι ανοσολογικής απόρριψης μειώνουν τα οφέλη τους. Έχουν μελετηθεί διάφοροι τύποι κυττάρων, όπως οι ινοβλάστες του δέρματος, για την ανάπτυξη υποκατάστατων ιστών για την αποκατάσταση τενόντων και συνδέσμων. Ωστόσο, η παρατεταμένη in vitro καλλιέργεια, το κόστος, η απώλεια του φυσικού φαινοτύπου των τενοκυττάρων και η έλλειψη αξιόπιστων διαδικασιών διαφοροποίησης εμποδίζουν την κλινική εφαρμογή αυτών των προϊόντων. Η τεχνολογία μακρομοριακής συνωστισμένης φαίνεται να επιταχύνει την ανάπτυξη λειτουργικών προτύπων ιστών. Σε αυτήν την εργασία, μελετήθηκαν οι καλλιέργειες ανθρώπινων τενοκυττάρων και ινοβλαστών του δέρματος υπό τυπικές και συνθήκες μακρομοριακής συνωστισμένης. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλές ομοιότητες, υπογραμμίζοντας το δυναμικό του συνδυασμού των ινοβλαστών με τη μακρομοριακή συνωστισμένη για τη μηχανική επεξεργασία ιστού τένοντα. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η τεχνολογία αυτή όχι μόνο επιταχύνει την αποθέτηση εξωκυττάριου μήτρας, αλλά ενισχύει επίσης αιμοστατικές, αντιμικροβιακές και προστατευτικές δραστηριότητες, μειώνοντας τους κινδύνους για την ανάπτυξη προϊόντων ιατρικής θεραπείας. Επιπρόσθετα, η μελέτη έδειξε ότι τα ανθρώπινα τενοκύτταρα παράγουν μεγαλύτερες ποσότητες TGFB2 σε σύγκριση με τους ινοβλάστες του δέρματος, πράγμα που υποδεικνύει ότι αυτός ο αυξητικός παράγοντας μπορεί να μετατοπίσει το φαινότυπο των ινοβλαστών προς την τενοντική γραμμή. Έτσι, δημιουργήθηκε ένα μικροπεριβάλλον που μιμείται τον τένοντα in vitro, χρησιμοποιώντας ανισότροπο υποστρώμα βιοϋλικού, TGFB2 και μακρομοριακή συνωστισμένη σε μια πολυπαραγοντική προσέγγιση. Η προσέγγιση αυτή αξιολογήθηκε για την επανειδίκευση των ανθρώπινων τενοκυττάρων και τη μετατροπή των ινοβλαστών του δέρματος προς την τενοντική γραμμή. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν την αξία αυτών των σημάτων του μικροπεριβάλλοντος στην εξομοίωση των χαρακτηριστικών του τένοντα, διευκολύνοντας την ανάπτυξη ενός μικροπεριβάλλοντος in vitro που μιμείται τα χαρακτηριστικά του φυσικού τένοντα και είναι ικανό να επανειδικεύσει τα ανθρώπινα τενοκύτταρα και να μετατρέψει τους ινοβλάστες του δέρματος προς την τενοντική γραμμή. Αυτή η προσέγγιση οδήγησε στην παραγωγή μηχανικών κατασκευών ιστού με τενοντικά κύτταρα τοποθετημένα παράλληλα και ενσωματωμένα σε πυκνή εξωκυττάρια μήτρα με ανισότροπη δομή. Οι κατασκευές αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για καινοτόμες θεραπείες τένοντα, μικροφυσιολογικά συστήματα, βασική έρευνα, μοντελοποίηση ασθενειών και ανακάλυψη φαρμάκων.