3D bioprinting of vascularized bone grafts using human adult stem cells and cell-instructive biomaterials under mechanical stimulation

Abstract

Current medical practice still faces significant challenges in treating large bone defects caused by trauma or disease. The main causes of large graft failure are inner graft necrosis and lack of integration with the host tissue due to poor vascularization. Developing bone grafts that can restore vascular function to the regenerating bone tissue has been the most difficult aspect to address. This thesis explores the critical role of vascularization in enhancing bone tissue engineering outcomes. Acknowledging the potential of 3D bioprinting in bioengineering complex tissues, this study introduces a dual-layered 3D bioprinted vascularized bone model aiming to promote bone regeneration under physiological mechanical loading. The inner layer comprises a vascular-like matrix created from a nanocomposite ink of gellan gum, laponite, and platelet-rich plasma (PRP), with laponite serving as a carrier for the PRP-containing bioactive growth factors, along with Wharton-jelly mesenchymal stem cells. The outer layer features a bone-like matrix containing bone marrow mesenchymal stem cells encapsulated in a photocrosslinkable blend of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA), gelatin, and poly(vinyl alcohol). The electrically conductive poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) is introduced in the outer layer to enhance the activity of voltage-gated channels, facilitating calcium ion flow across the cell membrane, amplifying the signal triggered by mechanical stimulation. Dynamic cell cultures performed in the presence of mechanical stimulation within a bioreactor were employed to mimic the physiological environment of native bone tissue. The synergistic cellular and molecular interactions of the dual-layered constructs significantly enhance the osteogenic and angiogenic differentiation due to paracrine signaling. Key markers of osteogenesis and angiogenesis showed significant upregulation in response to mechanical stimulation, particularly in the dynamic cultures. The complex bioprinted constructs demonstrated excellent in vitro biocompatibility, without observing any adverse foreign body reaction following in vivo subcutaneous implantation in mice. The mechanoresponsive biofabricated platform has great potential to promote vascularized bone regeneration

Η σύγχρονη ιατρική πρακτική εξακολουθεί να αντιμετωπίζει σημαντικές προκλήσεις στην αντιμετώπιση μεγάλων οστικών ελλειμμάτων που προκαλούνται από τραύματα ή ασθένειες. Οι κύριες αιτίες αποτυχίας μεγάλων μοσχευμάτων είναι η νέκρωση του μοσχεύματος και η έλλειψη ενσωμάτωσης με τον ιστό του ξενιστή λόγω κακής αγγείωσης. Η ανάπτυξη οστικών μοσχευμάτων που μπορούν να αποκαταστήσουν τη λειτουργία των αιμοφόρων αγγείων στον αναγεννώμενο οστικό ιστό αποτελεί τη μεγαλύτερη πρόκληση. Αυτή η διατριβή διερευνά τον κρίσιμο ρόλο της αγγείωσης στη βελτίωση των αποτελεσμάτων της μηχανικής οστικού ιστού. Αναγνωρίζοντας τη δυναμική της τρισδιάστατης βιοεκτύπωσης στη βιομηχανική σύνθετων ιστών, η παρούσα μελέτη παρουσιάζει ένα διστρωματικό τρισδιάστατο βιοεκτυπωμένο αγγειωμένο μοντέλο οστού, το οποίο στοχεύει στην προαγωγή της αναγέννησης του οστού υπό φυσιολογικές μηχανικές φορτίσεις. Το εσωτερικό στρώμα αποτελείται από μία αγγειακή μήτρα, φτιαγμένη από νανοσύνθετο μελάνι αποτελούμενο από κόμμι γκελλάνης, λασπολίτη και πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (PRP), με τον λασπολίτη να λειτουργεί ως φορέας των αυξητικών παραγόντων που περιέχονται στο PRP, μαζί με μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα του ζελέ του Wharton. Το εξωτερικό στρώμα διαθέτει μία μήτρα ομοιάζουσα με οστό, που περιέχει μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα μυελού των οστών, εγκλωβισμένα σε φωτοδιασταυρούμενο μείγμα πολυ(αιθυλενογλυκόλης) διακρυλικού (PEGDA), ζελατίνης και πολυ(αλκοόλης βινυλίου). Το ηλεκτρικά αγώγιμο πολυ(3,4-αιθυλενοδιοξυθειοφαίνιο) (PEDOT) προστίθεται στο εξωτερικό στρώμα για την ενίσχυση της δραστηριότητας των διαύλων που ελέγχονται από την τάση, διευκολύνοντας τη ροή των ιόντων ασβεστίου μέσω της κυτταρικής μεμβράνης και ενισχύοντας το σήμα που προκαλείται από τη μηχανική διέγερση. Οι δυναμικές κυτταροκαλλιέργειες, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν παρουσία μηχανικής διέγερσης μέσα σε ένα βιοαντιδραστήρα, χρησιμοποιήθηκαν για να μιμηθούν το φυσιολογικό περιβάλλον του φυσικού οστικού ιστού. Οι συνεργιστικές κυτταρικές και μοριακές αλληλεπιδράσεις των διστρωματικών κατασκευών ενισχύουν σημαντικά τη διαφοροποίηση σε οστεογενή και αγγειογενή κύτταρα λόγω παρακρινικής σηματοδότησης. Σημαντικοί δείκτες της οστεογένεσης και της αγγειογένεσης έδειξαν σημαντική αυξημένη έκφραση σε απόκριση στη μηχανική διέγερση, ιδιαίτερα στις δυναμικές καλλιέργειες. Οι σύνθετες βιοεκτυπωμένες κατασκευές επέδειξαν εξαιρετική βιοσυμβατότητα in vitro, χωρίς να παρατηρηθεί καμία ανεπιθύμητη αντίδραση ξένου σώματος μετά από υποδόρια εμφύτευση σε ποντίκια. Η μηχανοευαίσθητη βιοκατασκευασμένη πλατφόρμα έχει μεγάλο δυναμικό για την προώθηση της αγγειωμένης αναγέννησης οστού.