High-throughput computational analysis of non¬coding mechanisms and epigenetic marks in the pathophysiology of stress

Abstract

The core stress response (CSR) is essential for cellular adaptation to various stressors, maintaining homeostasis in both normal and disease states. This thesis investigates the molecular dynamics of the Core Stress Response (CSR) through a comprehensive bioinformatics approach, focusing on the regulatory roles of non-coding RNAs, particularly long non-coding RNAs, along with a multi-omics analysis of the composition and function of milk-derived exosomes and key elements of the milk microbiota. Using high-throughput computational analyses of multi-omics datasets, this research identifies potential biomarkers and therapeutic targets within CSR pathways, addressing both normal physiology and pathologies such as cancer. A central focus of this study is the characterization of stress-induced long non-coding RNAs (lncRNAs) across stress conditions including oxidative stress, DNA damage, hypoxia, and heat shock. In particular, KDM7A-DT and NORAD were identified as pivotal lncRNAs with high potential for diagnostic and therapeutic applications. KDM7A-DT showed significant upregulation in oxidative and hypoxic stress responses, highlighting its role in regulating pathways essential for both normal cellular function and breast cancer progression. NORAD, consistently expressed across multiple stress conditions, emerged as a potential universal stress marker and was notably downregulated in breast milk exosomes from preterm mothers, suggesting its role in DNA repair and potential as a biomarker for replication-related stress in infants. Milk-derived exosomes from human, bovine, and goat samples provided further insight into CSR regulation. Multi-omics profiling of these exosomes revealed species-specific differences in their cargo, with human exosomes displaying a broader range of immune-modulatory proteins, key stress-related metabolites, and lncRNAs compared to bovine and goat counterparts. This interspecies variation in exosomal content highlights milk exosomes as potential modulators of immune and stress responses, with implications for both infant and adult health. Additionally, the proteomic and metabolomic analysis underscores the stability and specificity of exosomal cargo as non-invasive biomarkers, supporting the use of milk-derived exosomes in real-time health monitoring and therapeutic applications. Further exploration of the milk microbiota revealed a core set of 16 genera shared across human and animal milk, including Acinetobacter, Corynebacterium, and Streptococcus, which constitute the foundational microbiome. This shared microbial community, examined across species, provides a basis for future research into the microbiota's role in immune modulation and cellular stress adaptation. These insights could inform nutritional strategies to enhance resilience against stress-related diseases in early life. This thesis bridges fundamental CSR research with potential clinical applications by integrating bioinformatic tools, generating extensive omics data, and developing new databases. Together, these findings lay the groundwork for advancing diagnostic, therapeutic, and personalized healthcare approaches to address stress-related health challenges.

Η απόκριση στο κυτταρικό στρες (CSR) αποτελεί ένα θεμελιώδη μηχανισμό που επιτρέπει στα κύτταρα να προσαρμόζονται σε οξείς και χρόνιους παράγοντες στρες, διαδραματίζοντας έναν καίριο ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης. Η διατριβή αυτή εστιάζει στην μοριακή δυναμική του CSR μέσω μιας διεξοδικής βιοπληροφορικής προσέγγισης, εξετάζοντας τον ρόλο των μη κωδικών RNAs και ιδιαίτερα των μακρών μη-κωδικοποιών RNAs (lncRNAs), καθώς και το μοριακό προφίλ των εξωσωμάτων του μητρικού γάλακτος σε συνδυασμό με το μικροβίωμα του, ως επιγενετικούς ρυθμιστές της απόκρισης στο στρες. Αξιοποιώντας πολυομικά σύνολα δεδομένων, η έρευνα αυτή προσφέρει νέες γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς μη-κωδικών ρυθμιστικών στοιχείων και επιγενετικών δεικτών στην απόκριση στο στρες, τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος. Η ανάλυση των lncRNAs που ενεργοποιούνται υπό συνθήκες στρες αποτελεί κεντρικό άξονα της παρούσας διατριβής. Με στόχο την κατανόηση της ευρύτερης εικόνας των βιοτύπων γονιδίων στο ανθρώπινο γονιδίωμα, χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο BioMart από τη βάση δεδομένων Ensembl για την κατηγοριοποίηση διαφορετικών τύπων μεταγράφων. Από την ανάλυση προέκυψε ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αποτελούν το 46,6% του ανιχνευμένου γονιδιώματος, ενώ τα lncRNAs αντιπροσωπεύουν το 41,1%. Το υπόλοιπο μέρος περιλαμβάνει διάφορους τύπους RNA, όπως τα miRNAs, rRNAs, snoRNAs, και snRNAs. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η κατάσταση σχολιασμού (annotation) των lncRNAs στο σύνολο δεδομένων μας. Από τα 17.687 αναγνωρισμένα lncRNAs, μόνο 5.726 είχαν καταχωρημένα Ensembl GeneIDs και επίσημα ονόματα γονιδίων, ενώ τα υπόλοιπα 11.961 χαρακτηρίστηκαν ως «νέες» αλληλουχίες χωρίς διαθέσιμο λεπτομερή λειτουργικό σχολιασμό. Επιπλέον, μόλις 218 από αυτά τα lncRNAs σχετίζονταν με λειτουργικούς όρους του Gene Ontology (GO), γεγονός που υπογραμμίζει την ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση των ρυθμιστικών τους ρόλων, ειδικά σε μονοπάτια απόκρισης στο στρες. Για να διερευνηθεί ο ρόλος των lncRNAs που επάγονται ως αποτέλεσμα της απόκρισης σε διάφορες συνθήκες στρες, πραγματοποιήθηκε μια συστηματική ανάλυση των διαθέσιμων RNA-seq συνόλων δεδομένων από τη βάση Gene Expression Omnibus (GEO). Συγκεκριμένα, συλλέχθηκαν 87 μελέτες RNA-seq, που περιλαμβάνουν 486 δείγματα, και καλύπτουν τέσσερις διαφορετικές συνθήκες στρες: οξειδωτικό στρες (επίδραση με H2O2), θερμικό σοκ, υποξία και υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Τα σύνολα δεδομένων που δημιουργήθηκαν αποτελούνται από δεδομένα έκφρασης αρκετών κυτταρικών σειρών έπειτα από επιδράσεις που ενεργοποιούν την απόκριση στο στρες, προσφέροντας αντιπροσωπευτική πληροφόρηση για τη μελέτη των μηχανισμών που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση σε συνθήκες στρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως 37 lncRNAs επάγονται συστηματικά και από τις τέσσερις καταστάσεις του στρες με κανονικοποιήμενη έκφραση μεγαλύτερη των 10 TPM. Μελετώντας ξεχωριστά την κάθε κατηγορία κυτταρικού στρες, ανιχνεύτηκαν ειδικά μόρια για την κάθε απόκριση. Πιο συγκεκριμένα, τα lncRNA KDM7A-DT και NORAD εντοπίστηκαν ως καίριοι ρυθμιστές της απόκρισης στο στρες, με μοτίβα έκφρασης παρόμοια με εκείνα των κλασικών mRNA που σχετίζονται με το στρες, τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Το KDM7A-DT παρουσίασε σημαντική υπερέκφραση σε συνθήκες οξειδωτικού στρες και υποξίας, υπογραμμίζοντας τον ρόλο του στη ρύθμιση κρίσιμων μονοπατιών στρες, ενώ το NORAD έδειξε σταθερή έκφραση σε πολλαπλές συνθήκες στρες, προσδίδοντάς του δυναμική ως γενικευμένο δείκτη στρες. Η μελέτη του lncRNA KDM7A-DT και η συσχέτισή του με την απόκριση στο στρες και τον καρκίνο του μαστού παρουσιάζουν σημαντικές προοπτικές για την κατανόηση του μηχανισμού της κυτταρικής προσαρμογής. Μέσα από αναλύσεις RNA-seq και μικροσυστοιχιών, αποκαλύφθηκε ότι το KDM7A-DT συμμετέχει σε μονοπάτια στρες που εμπλέκονται σε βασικές βιολογικές διεργασίες. Συγκεκριμένα, η έκφραση του KDM7A-DT σχετίστηκε με σημαντικά μονοπάτια, όπως η απόκριση ιντερφερόνης, η μοριακή σηματοδότηση μέσω TNFα και η απόπτωση, τόσο σε φυσιολογικά όσο και σε καρκινικά κύτταρα. Τα επίπεδα του KDM7A-DT παρατηρήθηκαν αυξημένα σε συνθήκες οξειδωτικού στρες και υποξίας, υποδεικνύοντας έναν πιθανό ρυθμιστικό ρόλο σε βασικές αποκρίσεις στο στρες. Η ανάλυση των δεδομένων έδειξε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση του KDM7A-DT σε ορισμένους υποτύπους καρκίνου του μαστού, όπως οι Luminal και Basal, με τα υψηλά επίπεδα έκφρασης να συσχετίζονται με την αυξημένη ανευπλοειδία και την γενετική αστάθεια στον πιο επιθετικό υπότυπο Basal. Η περαιτέρω ανάλυση των υποτύπων του καρκίνου του μαστού έδειξε ότι υψηλή έκφραση του KDM7A-DT μπορεί να αξιοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης, διακρίνοντας υποκατηγορίες κινδύνου σε όρους επιβίωσης χωρίς υποτροπή (RFS), συνολικής επιβίωσης (OS) και μακρινής επιβίωσης χωρίς μετάσταση (DMFS). Συνολικά, η διπλή λειτουργία του KDM7A-DT σε διαφορετικούς υποτύπους, ως ογκοκατασταλτικός παράγοντας ή προ-ογκογόνος ρυθμιστής, προβάλλει την κλινική σημασία του ως εν δυνάμει διαγνωστικού και προγνωστικού δείκτη.Τα lncRNAs μεταφέρονται συχνά μέσω των εξωσωμάτων και διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην κυτταρική σηματοδότηση και την απόκριση των κυττάρων σε ποικίλα ερεθίσματα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα εξωσώματα που βρίσκονται στο μητρικό γάλα, τα οποία συνδέονται άμεσα με την ανάπτυξη και την υγεία των βρεφών, καθώς μεταφέρουν ένα μοναδικό σύνολο βιοδραστικών μορίων, συμπεριλαμβανομένων των lncRNAs, τα οποία συμμετέχουν στην ανοσολογική ωρίμανση και τον μεταβολισμό των νεογνών. Στην παρούσα μελέτη, αναλύθηκαν εξωσώματα μητρικού γάλακτος μέσω πολυομικών προσεγγίσεων, αποκαλύπτοντας την παρουσία περισσοτέρων από 800 lncRNAs, συμπεριλαμβανομένων των KDM7A-DT και NORAD. Ορισμένα από αυτά τα lncRNAs έχουν συνδεθεί με μηχανισμούς κυτταρικής απόκρισης στο στρες και υποστηρίζεται πως ίσως έχουν βραχυπρόθεσμο και μακροπρόθεσμο αντίκτυπο στην ανάπτυξη των βρεφών. Συνεπώς, καθώς η κατανάλωση αγελαδινού και κατσικίσιου γάλακτος είναι διαδεδομένη παγκοσμίως ως εναλλακτική του μητρικού γάλακτος, μια πολυεπίπεδη συγκριτική ανάλυση των εξωσωμάτων από ανθρώπινο, αγελαδινό και κατσικίσιο γάλα αναμένεται να παράσχει χρήσιμες πληροφορίες για τη βελτίωση των υποκατάστατων τροφών. Η διαπίστωση των ομοιοτήτων και διαφορών στη σύσταση των εξωσωμάτων μεταξύ των ειδών μπορεί να συμβάλει στη βελτιστοποίηση των προϊόντων που προορίζονται για τη διατροφή των νεογνών, ώστε να προσφέρουν παρόμοια οφέλη με το μητρικό γάλα.Η ανάλυση των εξωσωμάτων ανθρώπινου, αγελαδινου και κατσικίσιου γάλακτος ανέδειξε διαφορές στο μοριακό φορτίο τους, με σημαντική ποικιλομορφία στο πρωτεϊνικό φορτίο που συνδέεται με την ανοσορύθμιση. Αυτή η ποικιλομορφία στο πρωτεϊνικό προφίλ υποδηλώνει ότι τα εξωσώματα του γάλακτος μπορούν να λειτουργήσουν ως βιοδείκτες που σχετίζονται με την προσαρμογή σε συνθήκες στρες αλλά και ως δυνητικοί φορείς για θεραπευτικές εφαρμογές. Το μεταβολομικό προφίλ των εξωσωμάτων αποκάλυψε την παρουσία βασικών μεταβολιτών που εμπλέκονται σε μονοπάτια που σχετίζονται με το στρες, όπως η μεταβολική ρύθμιση της ενέργειας και η προσαρμογή σε οξειδωτικό στρες. Το ανθρώπινο γάλα παρουσίασε υψηλότερη ποικιλομορφία σε μεταβολίτες σε σύγκριση με το αγελαδινό και κατσικίσιο γάλα, γεγονός που υποδεικνύει μια πιο πολύπλοκη ρυθμιστική λειτουργία στην απόκριση στο στρες και στην ανοσολογική ρύθμιση. Αυτές οι παρατηρήσεις παρέχουν έναν σύνδεσμο μεταξύ του εξωσωμικού φορτίου και της ρύθμισης των αποκρίσεων στο στρες, ενώ η σταθερότητα των εξωσωμάτων και η μη επεμβατική τους ανίχνευση τα καθιστούν κατάλληλους υποψήφιους δείκτες για την παρακολούθηση της εξέλιξης παθολογικών καταστάσεων. Παράλληλα, η μικροβιακή ανάλυση των δειγμάτων γάλακτος ανέδειξε επίσης κοινές ομάδες βακτηρίων μεταξύ ανθρώπινου και ζωικού γάλακτος, υποδεικνύοντας ένα κοινό μικροβίωμα, το οποίο περιλαμβάνει γένη όπως τα Acinetobacter, Corynebacterium, Gemella, Staphylococcus, Streptococcus και Pseudomonas. Αυτή η σύνθεση αποκαλύπτει τις βασικές βιολογικές διεργασίες και τη λειτουργική ποικιλομορφία του γάλακτος, ενώ παράλληλα προσφέρει το υπόβαθρο για τη διαμόρφωση νέων διατροφικών προτύπων που μπορούν να προάγουν την υγεία των καταναλωτών. Συνολικά, τα ευρήματα από τη μικροβιακή και εξωσωμική ανάλυση, μπορούν να αξιοποιηθούν για βελτίωση της ποιότητας του μητρικού γάλακτος.Συνοψίζοντας, η παρούσα διατριβή εστιάζει στη θεμελιώδη σημασία των lncRNAs, των εξωσωμάτων και του μικροβιώματος ως κρίσιμων παραγόντων που επηρεάζουν την κυτταρική απόκριση στο στρες. Μέσω μιας συνδυαστικής πολυομικής προσέγγισης, η ανάλυση αυτή αναδεικνύει νέες πτυχές των μηχανισμών που στηρίζουν την κυτταρική ομοιόσταση υπό συνθήκες στρες. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν τη σημασία των lncRNAs και ιδιαίτερα του KDM7A-DT, που συμμετέχει σε ρυθμιστικά μονοπάτια στρες, καθώς και του NORAD, το οποίο φαίνεται να έχει δυναμική ως δείκτης γενικευμένου στρες. Παράλληλα, η μελέτη των εξωσωμάτων του μητρικού γάλακτος έδειξε σημαντικές διαφορές στη μοριακή τους σύνθεση σε σχέση με τα εξωσώματα από γάλα άλλων ειδών, προσφέροντας πολύτιμες γνώσεις για την ενίσχυση της διατροφικής αξίας των εναλλακτικών υποκατάστατων του μητρικού γάλακτος. Η παρουσία βασικών βιολογικών μορίων και η σταθερότητα των εξωσωμάτων καθιστούν τα φορτία τους υποψήφιους βιοδείκτες και θεραπευτικούς φορείς για τη διαχείριση παθολογικών καταστάσεων. Επιπλέον, η ανάλυση των κοινών μικροβίων στο ανθρώπινο και ζωικό γάλα αναδεικνύει τη δυναμική μιας ενιαίας μικροβιακής βάσης για μελλοντικές εφαρμογές σε διατροφικά και θεραπευτικά μοντέλα υγείας. Η ενσωμάτωση της βιοπληροφορικής ανάλυσης καταδεικνύει την επιγενετική επιρροή του στρες στην έκφραση των γονιδίων και προσφέρει μια ολιστική πολυομική θεώρηση της απόκρισης στο στρες. Τα ευρήματα αυτά συνιστούν το υπόβαθρο για τη δημιουργία νέων στρατηγικών που αποσκοπούν στην ανάπτυξη μη επεμβατικών διαγνωστικών εργαλείων και στοχευμένων θεραπευτικών μεθόδων, με σκοπό τη πρόληψη έναντι παθολογικών καταστάσεων και την ενίσχυση της συνολικής υγείας και ευεξίας.