Ανάπτυξη μεθοδολογίας με τη χρήση miRNAs και κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο αίμα, για την ανίχνευση πρωτοπαθούς και μεταστατικού ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ) σε πρώιμα στάδια σε ασθενείς με HBV ή HCV λοίμωξη

Abstract

Malignant tumors of the liver usually appear as nodules in the liver parenchyma. In patients with cirrhosis with nodules, hepatocellular carcinoma is mainly diagnosed using 6-month follow-up imaging techniques. Our goal was to identify molecular signatures based on the profile of proteins, miRNAs and circulating cancer cells (CTCs) that would determine and predict the development of HCC at a very early stage. Materials and methods: blood of 89 patients with hepatocellular carcinoma (HCC) (56 patients of advanced age with advanced HCC and 33 patients with early HCC), 28 HBV or HCV positive HRK-positive patients and 5 healthy controls were screened for CTCs by immunofluorescence using PCR and q the markers EPCAM, Vimentin, AFP and Major Vault surface protein (sMVP). Patients' serum was also tested for the presence of a set of miRNAs involved in HCC (miR122, miR221, miR222, miR200a and miR200b) by qRT-PCR, as well as for protein signatures by proteome analysis (LC / MS).Results: 27/73 patients with advanced HCC had CTCs, with 10 out of 27 showing signs of mesenchymal or intermediate-stage CTCs (positive vimentin and / or sMVP). 4/33 patients with early HCC and 3 of 28 cirrhotic patients had CTCs. Patients with HCC showed a statistically significant decrease in miR-200a and miR-200b (p <0.05 in both cases) compared to cirrhotic patients. Finally, proteome analysis, using strict criteria, showed a significant increase in a range of lipoproteins in patients with early HCC compared with cirrhotic patients, two of which APOA2 and APOC3 combined cover 100% of patients with early HCC. Conclusions: This study demonstrates the clinical utility of mir-200a and miR-200b in combination with the proposed serum APOA2 and APOC3, as a clinical tool for the determination of early HKK.

Οι κακοήθεις όγκοι στο ήπαρ εμφανίζονται συνήθως ως οζίδια στο ηπατικό παρέγχυμα. Σε ασθενείς με κίρρωση που παρουσιάζουν οζίδια, το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα διαγιγνώσκεται κυρίως με τη χρήση τεχνικών απεικόνισης με παρακολούθηση για 6 μήνες. Στόχος μας ήταν να προσδιορίσουμε μοριακές υπογραφές με βάση το προφίλ πρωτεϊνών, miRNA και κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTCς) που θα καθορίσουν και θα προβλέψουν την ανάπτυξη HΚΚ σε πολύ πρώιμα στάδια. Μέθοδοι: αίμα 89 ασθενών με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HΚΚ) (56 ασθενείς αντίστοιχης ηλικίας με προχωρημένο HΚΚ και 33 ασθενείς με πρώιμο HΚΚ), 28 HBV ή HCV θετικοί κιρρωτικοί ασθενείς χωρίς ένδειξη HΚΚ και 5 υγιείς μάρτυρες εξετάστηκαν για CTCs με ανοσοφθορισμό και qRT-PCR χρησιμοποιώντας τους δείκτες EPCAM, Vimentin, AFP και πρωτεΐνη Major Vault επιφανείας (sMVP). Ο ορός ασθενών εξετάστηκε επίσης για την παρουσία ενός συνόλου miRNA που εμπλέκονται στο HΚΚ (miR122, miR221, miR222, miR200a και miR200b) με qRT-PCR, καθώς και για πρωτεϊνικές υπογραφές με ανάλυση πρωτεόματος (LC / MS). Αποτελέσματα: 27/73 ασθενείς με προχωρημένο HΚΚ παρουσίασαν CTCs, με τους 10 στους 27 να παρουσιάζουν ενδείξεις μεσεγχυματικών ή ενδιάμεσων σταδίων CTCs (θετική βιμεντίνη ή/και sMVP). 4/33 ασθενείς με πρώιμο HCC και 3 από τους 28 κιρρωτικούς ασθενείς παρουσίασαν CTCs. Οι ασθενείς με HCC παρουσίασαν στατιστικά σημαντική μείωση στα miR-200a και miR-200b (p <0,05 και στις δυο περιπτώσεις) σε σύγκριση με τους κιρρωτικούς ασθενείς. Τέλος, η ανάλυση πρωτεόματος, χρησιμοποιώντας αυστηρά κριτήρια, έδειξε σημαντική αύξηση μιας γκάμας λιποπρωτεϊνών σε ασθενείς με πρώιμο HCC σε σύγκριση με τους κιρρωτικούς ασθενείς, Δύο εκ των οποίων, η APOA2 και η APOC3 συνδυαστικά, καλύπτουν το 100% των ασθενών με πρώιμο ΗΚΚ. Συμπεράσματα: H μελέτη αυτή καταδεικνύει την κλινική χρησιμότητα των mir-200a και miR-200b σε συνδυασμό με τις πρωτεΐνες APOA2 και APOC3 στον ορό, ως κλινικό εργαλείο για τον καθορισμό του πρώιμου ΗΚΚ.