Ορθολογική επαναστόχευση φαρμάκων βασισμένη σε μεθόδους πρωτεϊνωματικής ανάλυσης βιολογίας και φαρμακολογίας συστημάτων σε λεμφοειδείς νεοπλασίες

Abstract

The present thesis focuses on the study of lymphoid neoplasms and the investigation of drug repurposing, aiming to improve the existing therapeutic approaches for these diseases. Even today, lymphoid neoplasms remain a significant cause of death with increasingly high incidence rates. In recent years, the development of holistic analysis technologies (-omics) has made it possible to better understand the complex biological processes leading to neoplasms. Specifically, proteomic analysis promises to provide a deeper understanding of the action of key bioactive molecules within the cell, the proteins. The research methodology included both computational (in silico) and experimental (in vitro) analyses. The computational analysis gathered data on Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) with the goal of identifying prognostic proteins and discovering new therapeutic targets. This data is used to find new therapeutic molecules with an emphasis on already approved therapies (drug repurposing methodology). The experimental analysis evaluated the actions of the repurposed drugs in various cell lines using molecular and biochemical techniques, as well as mass spectrometry analysis. For the computational analysis, a detailed recording of recent proteomic studies in CLL was initially performed. The goal was to capture the current knowledge regarding protein expression related to the development and progression of the disease. Based on this analysis, three studies were selected and utilized, which compared the proteomic signatures of patients with CLL to those of healthy individuals. Through the integration of the data, differentially expressed proteins were identified that could serve as potential biomarkers for the diagnosis or prognosis of the disease, such as YEATS2, PIGR, BTF3, SNRPA, and NUTF2. Furthermore, the computational analysis suggests the repurposing of the drugs Bosutinib, Vorinostat, and Panobinostat for the treatment of CLL. In the experimental analysis, the data derived from the computational approach is utilized, with emphasis given on the molecular, pharmacological and biochemical analysis of the identified molecular drugs. Initially, the compound Fostamatinib (R406) was evaluated in six different cell lines from three lymphoid neoplasms. R406 demonstrated statistic significant cytotoxic activity, and thus it was further studied in synergy with Nutlin-3a (N3a), a well-documented anti- cancer agent. Similarly, cannabidiol (CBD) was also shown effective in killing cancer cells, achieving significant cytotoxic effects across all studied cell lines and especially Mec1 cell line (CLL). Additionally, proteomic analysis of the cells exposed to CBD was conducted using mass spectrometry, revealing that CBD affects multiple cellular processes. Specifically, it appears to influence mRNA alternative splicing, a crucial process for protein production, apoptosis (cell death), and mitochondrial function, which is vital for energy production in cells. In conclusion, this doctoral dissertation provides a combined analysis of multiple -omics data at both in silico and in vitro levels in lymphoid neoplasms. The findings highlight the potential for a better understanding of cancer cells and support the possible discovery of new anticancer therapies through drug repurposing.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στη μελέτη των λεμφοειδών νεοπλασιών και τη διερεύνηση της επαναστόχευσης φαρμάκων, με σκοπό τη βελτίωση των θεραπευτικών προσεγγίσεων για αυτές τις ασθένειες. Ακόμη και σήμερα, οι λεμφοειδείς νεοπλασίες παραμένουν μία σημαντική αιτία θανάτου με διαρκώς αυξανόμενα ποσοστά εμφάνισης. Τα τελευταία χρόνια, η ανάπτυξη των τεχνολογιών ολιστικής ανάλυσης (-omics), καθιστούν δυνατή την καλύτερη κατανόηση των πολύπλοκων βιολογικών διεργασιών που οδηγούν σε νεοπλάσματα. Ειδικότερα, η πρωτεϊνωματική ανάλυση υπόσχεται να προσφέρει βαθύτερη κατανόηση της δράσης των κύριων βιοενεργών μορίων μέσα στο κύτταρο, τις πρωτεΐνες. Η ερευνητική μεθοδολογία συνδύασε τόσο υπολογιστικές αναλύσεις (in- silico) όσο και πειραματικές μελέτες (in- vitro). Στο πλαίσιο της υπολογιστικής ανάλυσης, συγκεντρώθηκαν διαθέσιμα δεδομένα για τη Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (CLL), με στόχο την ταυτοποίηση πρωτεϊνών με προγνωστικό χαρακτήρα και την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών στόχων. Τα δεδομένα αυτά αξιοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό θεραπευτικών μορίων με έμφαση τις ήδη εγκεκριμένες θεραπείες (μεθοδολογία επαναστόχευσης φαρμάκων). Στην πειραματική ανάλυση αξιολογήθηκαν οι δράσεις των επιλεγμένων επαναστοχευμένων φαρμάκων σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές με τη χρήση μοριακών και βιοχημικών τεχνικών. Για την υπολογιστική ανάλυση, αρχικά, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής καταγραφή των σύγχρονων μελετών πρωτεϊνωματικής ανάλυσης στη CLL. Στόχος ήταν να αποτυπωθεί η τρέχουσα γνώση σχετικά με τις πρωτεϊνικές διαφοροποιήσεις που σχετίζονται με την ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου. Με βάση αυτή την ανάλυση, επιλέχθηκαν και αξιοποιήθηκαν τρεις μελέτες, οι οποίες συνέκριναν τις πρωτεϊνωματικές υπογραφές ασθενών με CLL και υγιών ατόμων. Μέσω της ενσωμάτωσης των δεδομένων αυτών μεταξύ τους, αλλά και με διαθέσιμα αντίστοιχα δεδομένα μεταγραφωματικής ανάλυσης, εντοπίσθηκαν διαφορικά ρυθμισμένες πρωτεΐνες που μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί βιοδείκτες για τη διάγνωση ή την πρόγνωση της νόσου (YEATS2, PIGR, SNRPA, NUTF2). Επιπλέον, μέσω της υπολογιστικής ανάλυσης προτάθηκε η περαιτέρω διερεύνηση της επαναστόχευσης των φαρμάκων Bosutinib, Vorinostat και Panobinostat για τη θεραπεία της CLL. Στην πειραματική ανάλυση, αξιοποιήθηκαν τα δεδομένα που προέκυψαν από την υπολογιστική προσέγγιση και δόθηκε έμφαση στη μοριακή, φαρμακολογική και βιοχημική ανάλυση των εντοπισμένων φαρμάκων. Αρχικά, αξιολογήθηκε η ουσία Fostamatinib (R406) σε έξι διαφορετικές κυτταρικές σειρές από τρεις υπότυπους λεμφοειδών νεοπλασιών. Η R406 επέδειξε στατιστικά σημαντική κυτταροτοξική δράση και μελετήθηκε και σε συνέργεια με την Nutlin-3a (N3a), η οποία αποτελεί μία μικρομοριακή υπό κλινικές μελέτες ένωση με σημαντική ογκοκατασταλτική δράση. Επιπλέον, μελετήθηκε η κανναβιδιόλη (CBD) η οποία καταγράφηκε ως εξίσου αποτελεσματική στην καταπολέμηση των καρκινικών κυττάρων, επιτυγχάνοντας σημαντική αποπτωτική δράση σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, με έμφαση στην κυτταρική σειρά Mec1 (CLL). Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε πρωτεϊνωματική ανάλυση των κυττάρων μετά την επώαση με CBD με τη χρήση φασματομετρίας μάζας, η οποία αποκάλυψε την επίδραση της CBD σε πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες. Συγκεκριμένα, η CBD έδειξε να επηρεάζει το εναλλακτικό μάτισμα του mRNA, μια διαδικασία κρίσιμη για την παραγωγή πρωτεϊνών, την απόπτωση (κυτταρικό θάνατο), καθώς και τη μιτοχονδριακή λειτουργία, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για την παραγωγή ενέργειας στα κύτταρα. Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελεί μια συνδυαστική ανάλυση πολλαπλών -omics δεδομένων σε in-silico και in-vitro επίπεδο, στις λεμφοειδείς νεοπλασίες. Τα ευρήματα επισημαίνουν τις προοπτικές για την καλύτερη κατανόηση των καρκινικών κυττάρων, αλλά και ενισχύουν την πιθανή ανακάλυψη νέων αντικαρκινικών θεραπειών μέσω της επαναστόχευσης φαρμάκων.