Μοριακή χαρτογράφηση γηγενών ποικιλιών φασολιών (P. coccineus L.) και φυσικοχημικές ιδιότητες συστατικών και προϊόντων τους

Abstract

Legumes (Fabaceae family) are widely regarded as important foods, constituting a part of the nutritionally recommended diverse, healthy and environmentally sustainable diets. In particular, beans (Phaseolus genus) have become one of the most important staple crops in the world. They have been introduced to Europe from Central America and since then they have been scattered to different geographical regions in the globe resulting in the generation of numerous local cultivars. To identify and characterize the underlying genomic variation, RNA sequencing (RNA-Seq) with de novo transcriptome assembly was performed to assess the differential gene expression in two closely related P. coccineus L. populations, "Gigantes " (G) and "Elephantes" (E) of Prespa region, phenotypically distinct, differing in seed size and shape. The latter are Protected Geographical Indication (PGI) products and were obtained after a three-years breeding – selection (3 consecutive years of cultivation) program of an initial mixed population (Gigantes-Elephantes Prespon and a local P. vulgaris population). In addition, these populations (“Gigantes” (G) and “Elephantes (E) of Prespa region) were genetically characterized in comparison with 12 additional P. coccineus L. varieties (grown in other locations in Greece), obtained from the Gene Bank, to determine the genetic variation of P. coccineus L. species. Genetic diversity among the varieties/populations was assessed by two molecular methods: (a) capillary electrophoresis and (b) High Resolution Melting analysis (HRM) using Simple Sequence Repeat (SSR) molecular markers and Expressed Sequence Tag (EST) markers, designed on the basis of transcriptomics analysis. The ‘G’ and ‘E’ Prespon populations exhibited gene expression variation among them enabling the robust identification of P. coccineus L. varieties and the construction of high-resolution genetic maps. They were also genetically separated, among these and from other domestic P. coccineus L. varieties (1-12) by both molecular methods, a fact that supports a unique genetic identity of the Prespon beans. Overall, genetic characterization of the abundant Greek bean germplasm using molecular markers can aid in the genetic identification, thus preventing any form of fraudulent practices as well as supporting traceability management strategies for identification-authenticity purposes, and protection of the origin of local certified products. In this sense, DNA barcoding of some plant species of the Phaseolus and Vicia genus was also carried out, in order to resolve the still unclear genetic relationship between these two genera of the Fabaceae family, demonstrating their distinct genetic differentiation. Beans are also highly valued as a food item for human consumption because of its high protein, starch and fibers content, contributing to improvement of human health and preventing various chronic diseases. In recent decades, there has been an interest on the use of legume flours in food formulations, due to the growing consumer demand for products rich in protein content, particularly from plant origin, and thereby resulted in an increasing research attention on composite cereal-legume flours for production of bakery products. In the present study, wheat flour was substituted by flours from raw or roasted beans (Gigantes-Elephants Prespon) at 20 and 30% levels in breadmaking. The crystalline structure (C- type, typical of many legume starches) and the thermal properties of starch and flours of the Prespon beans, along with their cooking behavior were examined; the ease to boiling of these seeds was reflected on the fuzzy boundaries between the cell walls following their cooking in water, as evidenced by scanning electron microscopy. For mixed wheat-bean flour doughs formulated in breadmaking, the rheological behavior of the composite starch-proteins hydrated networks of the composite doughs were evaluated and indicated increased viscosity values, compared to pure wheat flour dough (oscillatory rheological testing). The specific loaf volume of fortified breads with roasted beans was higher, compared to those made with raw bean flour, and was similar to that of wheat flour bread (CON). The texture profile analysis of the fortified breads with the raw bean flour indicated a greater degree of crumb hardening at the end of storage, despite the lower extent of amylopectin retrogradation, as determined calorimetrically (DSC). FTIR spectroscopy for breads containing bean flours showed little differentiations in the secondary protein structures between fresh and stored crumbs; generally, the β-type structures (β-sheet, aggregates and β-turn) prevailed in all examined samples at the expense of other secondary conformational elements in the composite crumb protein networks. The in vitro starch digestibility of the fortified breads also showed reduced glucose release responses compared to control bread (CON). Moreover, the typical "beany" flavor notes in the fortified breads were masked using the roasted bean flour at the tested fortification levels, resulting in a more favourable overall acceptability for the 20%-substituted product, and revealing a modified profile of volatiles that provide a more pleasant sensory appeal to the baked product. In summary, the present study has contributed new knowledge in the area of legume science and technology, focusing on a complete evaluation of the ‘G’ and ‘E’ Prespon bean populations (P. coccineus L.) in terms both of molecular characterization, for preventing any form of adulteration, as well as physicochemical and technological aspects of the seeds, aiming towards the development of bakery products with improved quality and nutritional values.

Τα όσπρια (οικογένεια Fabaceae) θεωρούνται ευρέως ως σημαντικά τρόφιμα, αποτελώντας μέρος ποικίλων, θρεπτικών, υγιεινών και περιβαλλοντικά βιώσιμων διατροφών. Τα φασόλια ιδιαίτερα (γένος Phaseolus) αποτελούν μια από τις πιο σημαντικές βασικές καλλιέργειες στον κόσμο, λόγω του χαμηλού κόστους και της υψηλής διατροφικής τους αξίας. Εισήχθησαν στην Ευρώπη από την Κεντρική Αμερική και έκτοτε έχουν διασκορπιστεί σε διάφορες γεωγραφικές περιοχές του πλανήτη με συνέπεια τη δημιουργία πολυάριθμων τοπικών ποικιλιών. Για τον εντοπισμό και χαρακτηρισμό της υποκείμενης γονιδιωματικής παραλλακτικότητας πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του RNA (RNA-Seq) και εκ του μηδενός συναρμολόγηση (de novo assembly), με σκοπό να αξιολογηθεί η διαφορική έκφραση σε δύο στενά συνδεδεμένους πληθυσμούς P. coccineus L., «Γίγαντες» (Γ) και «Ελέφαντες» (Ε) της περιοχής Πρεσπών, με καταγραφή φαινοτυπικών διαφορών ως προς το μέγεθος, το σχήμα των σπερμάτων και άλλων χαρακτηριστικών. Οι τελευταίοι αποτελούν προϊόντα Προστατευόμενης Γεωγραφικής Ένδειξης (ΠΓΕ) και προέκυψαν μετά από τριετή καλλιέργεια ενός αρχικού μικτού πληθυσμού (Γίγαντες, Ελέφαντες και Πλακέ Πρεσπών) και διαδοχική επιλογή των σπερμάτων (3 διαδοχικά έτη καλλιέργειας) με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά. Πραγματοποιήθηκε γενετικός χαρακτηρισμός αυτών καθώς και 12 επιπλέον ποικιλιών P. coccineus L. (1-12) που αποκτήθηκαν από την Ελληνική Τράπεζα Συλλογής Σπερμάτων, με σκοπό την αποτύπωση της γενετικής παραλλακτικότητας του είδους P. coccineus L. Η γενετική παραλλακτικότητα μεταξύ όλων των ποικιλιών/πληθυσμών αξιολογήθηκε με δύο μοριακές μεθόδους: (α) Τριχοειδή ηλεκτροφόρηση και (β) Υψηλής ανάλυσης καμπύλες τήξης (High Resolution Melting analysis-HRM), χρησιμοποιώντας μοριακούς δείκτες απλής επαναλαμβανόμενης ακολουθίας (SSR) και δείκτες ετικέτες εκφραζόμενων αλληλουχιών απλής επαναλαμβανόμενης ακολουθίας (EST-SSR), σχεδιασμένους στη βάση της μεταγραφομηχανικής ανάλυσης. Οι πληθυσμοί "Γ" και "E" Πρεσπών εμφάνισαν γενετική διαφοροποίηση μεταξύ τους επιτρέποντας την ισχυρή αναγνώριση των ποικιλιών φασολιών και την κατασκευή γενετικών χαρτών υψηλής ανάλυσης, μιας και διαχωρίστηκαν γενετικά, τόσο μεταξύ τους όσο και από τις εγχώριες ποικιλίες P. coccineus L. (1-12) και με τις δύο μοριακές μεθόδους, γεγονός που υποδηλώνει τη μοναδική γενετική ταυτότητα των φασολιών Πρεσπών. Συνολικά, ο γενετικός χαρακτηρισμός των ελληνικών φασολιών με τη χρήση μοριακών δεικτών μπορεί να ωφελήσει στη γενετική ταυτοποίηση αυτών, αποτρέποντας έτσι κάθε μορφή δόλιας πρακτικής στην εμπορική τους διάθεση και υποστηρίζοντας στρατηγικές διαχείρισης της ιχνηλασιμότητας για αναγνώριση-αυθεντικότητα και προστασία των τοπικών πιστοποιημένων προϊόντων με σκοπό την ενίσχυση της εμπορίας αυτών. Στον άξονα αυτό, πραγματοποιήθηκε επιπλέον γενοτύπιση (DNA barcoding) ορισμένων φυτικών ειδών των γενών Phaseolus και Vicia, με σκοπό την επίλυση της ακόμη ασαφούς γενετικής συσχέτισης των δύο αυτών γενών της οικογένειας Fabaceae, αποδεικνύοντας την ευκρινή γενετική τους διαφοροποίηση. Το φασόλι αποτελεί, πολύτιμη καλλιέργεια για ανθρώπινη κατανάλωση, λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς του σε πρωτεΐνες, άμυλο και φυτικές ίνες, συμβάλλοντας στη βελτίωση της υγείας και παρεμποδίζοντας διάφορες χρόνιες ασθένειες. Τις τελευταίες δεκαετίες, υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη χρήση αλεύρων από όσπρια στην παραγωγή σύνθετων τροφίμων, λόγω της αυξημένης ζήτησης των καταναλωτών για προϊόντα πλούσια σε πρωτεϊνικό περιεχόμενο, από φυτική προέλευση πρώτες ύλες, και πιθανώς γι’ αυτό οι ερευνητές έχουν στρέψει την προσοχή τους στα σύνθετα άλευρα. Συχνό παράδειγμα αποτελεί η μερική αντικατάσταση του αλεύρου σίτου με άλευρο οσπρίων στο ψωμί, καθώς είναι ένα από τα πιο αναλώσιμα τρόφιμα παγκοσμίως. Για το λόγο αυτό, στην παρούσα μελέτη, το άλευρο σίτου αντικαταστάθηκε από άλευρο ωμών ή καβουρδισμένων φασολιών Γίγαντες-Ελέφαντες Πρεσπών σε ποσοστά 20 και 30% για την παρασκευή ψωμιού. Η βραστερότητα των φασολιών (Γ και Ε), η μακροσκοπική δομή των βρασμένων σπερμάτων, η κρυσταλλική δομή του αμύλου, η ρεολογική συμπεριφορά των σύνθετων ενυδατωμένων δικτύων αμύλου-πρωτεϊνών στη ζύμη και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του ψωμιού, συμπεριλαμβανομένης της χημικής σύστασης, της in vitro πεπτικότητας του αμύλου, των διεργασιών ‘παλαίωσης’ των αρτοσκευασμάτων, και του προφίλ των πτητικών ουσιών, εξετάστηκαν με τη χρήση πολλαπλών ενόργανων αναλυτικών τεχνικών. Η ευκολία των σπερμάτων των Γ και Ε στο βρασμό επιβεβαιώθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (ασαφή όρια μεταξύ των κυτταρικών τοιχωμάτων μετά το βρασμό), ενώ η κρυσταλλικότητα του αμύλου (ενδιάμεσος τύπος C-) βρέθηκε να είναι τυπική με εκείνη από άμυλα άλλων ειδών οσπρίων. Σε ζύμες αρτοποίησης, ο εμπλουτισμός αλεύρου σίτου με άλευρα φασολιών (μικτά άλευρα από σπέρματα Γ και Ε ως έχουν ή μετά από καβούρδισμα), οδήγησε σε αύξηση το ιξώδους της ζύμης, σύμφωνα με ρεολογικές δοκιμές μικρών παραμορφώσεων, υποδηλώνοντας υψηλότερη αντίσταση στη ροή και την παραμόρφωση. Παρ' όλα αυτά, ο ειδικός όγκος των εμπλουτισμένων ψωμιών με καβουρδισμένα φασόλια ήταν υψηλότερος, σε σύγκριση με εκείνα από άλευρο ωμών φασολιών, και συγκρίσιμος με το σιταρένιο ψωμί (μάρτυρας). Η ανάλυση του προφίλ της υφής των εμπλουτισμένων ψωμιών με αλεύρι ωμών φασολιών έδειξε μεγαλύτερο βαθμό σκλήρυνσης της ψίχας στο τέλος της αποθήκευσης, παρά τη μικρότερη έκταση επαναδιάταξης της αμυλοπηκτίνης, όπως προσδιορίστηκε θερμιδομετρικά (DSC). Η φασματοσκοπία FTIR για τα ψωμιά που περιείχαν αλεύρι φασολιών έδειξε μικρές διαφοροποιήσεις στις δευτεροταγείς πρωτεϊνικές δομές μεταξύ της φρέσκιας και της αποθηκευμένης ψίχας- γενικά, οι δομές τύπου β (β-φύλλο, συσσωματώματα και β-στροφή) επικράτησαν σε όλα τα εξεταζόμενα δείγματα εις βάρος άλλων δευτεροταγών στοιχείων διαμόρφωσης στα σύνθετα πρωτεϊνικά δίκτυα της ψίχας. Η in vitro πεπτικότητα του αμύλου των εμπλουτισμένων ψωμιών έδειξε μειωμένες αποκρίσεις απελευθέρωσης της γλυκόζης σε σύγκριση με το σιταρένιο ψωμί. Οι τυπικές γευστικές νότες «φασολιών» (beany flavor notes) στα εμπλουτισμένα ψωμιά με άλευρα φασολιών περιορίστηκαν με τη χρήση του καβουρδισμένου αλεύρου φασολιών, με αποτέλεσμα την ευνοϊκότερη συνολική αποδοχή του προϊόντος με 20% υποκατάσταση του σιταρένιου αλεύρου, δίνοντας παράλληλα ένα τροποποιημένο προφίλ πτητικών συστατικών και μια ευχάριστη οργανοληπτική απήχηση. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έχει συνεισφέρει στη διεύρυνση της επιστημονικής γνώσης για μια ολοκληρωμένη αξιολόγηση των πληθυσμών φασολιών «Γίγαντες» και «Ελέφαντες» Πρεσπών, τόσο από πλευράς μοριακού χαρακτηρισμού, αποτρέποντας κάθε μορφή νοθείας στη διάθεση αυτών των προϊόντων, όσο και από φυσικοχημικής και τεχνολογικής πλευράς, εστιάζοντας στην παραγωγή αρτοσκευασμάτων με βελτιωμένα ποιοτικά και διατροφικά χαρακτηριστικά.